Secuenciación y análisis genómico de Talaromyces sayulitensis HC1, Bacillus sp. CMPUJ 453 y Bacillus sp. CMPUJ 452: Filogenia y potencial metabólico para la conversión de residuos orgánicos

La demanda de alimentos de una población en crecimiento conlleva a su vez a una mayor generación de residuos sólidos. Según el Banco Mundial se espera que la generación de residuos industriales y domiciliarios aumente de 2010 millones de toneladas producidas en 2016 a 3400 millones de toneladas en los próximos 30 años a nivel global, siendo el 66% de estos residuos inorgánicos, plástico en su mayoría, y el 44% residuos orgánicos1. Adicional a los residuos industriales y domiciliarios, se generan otros residuos orgánicos provenientes de la industria maderera y de cultivos agrícolas dedicados a la producción de alimento y/o a la generación de biocombustibles 2. La producción mundial de estos últimos residuos es de aproximadamente 200 x 109 toneladas/año, la mayoría de estos proviene de cuatro cultivos, maíz, trigo, arroz y caña de azúcar 2,3. Lamentablemente, estos residuos no son aprovechados y se disponen de manera inadecuada, afectando la calidad del aire, suelo y agua, lo que a su vez tiene un impacto negativo en la salud, en el suplemento de alimentos, energía y agua dentro de las poblaciones 4. Estos tipos de residuos orgánicos (domiciliarios o industriales, residuos de la industria maderera y desechos agrícolas), pueden contener grandes cantidades de biomasa vegetal 2, la cual se define como materia orgánica que se puede convertir en energía 5. De esta manera, el escenario ideal para el manejo de estos residuos involucra la valorización de esta biomasa a través de procesos biocatalíticos eficientes, dejando el clásico esquema lineal extracción-transformación-uso-eliminación y sustituirlo por otro del tipo reducción-reciclaje-reutilización-recuperación, de acuerdo con los fundamentos de la economía circular 6.El 90 % de la biomasa vegetal es lignocelulosa 2, un sustrato complejo y difícil de degradar, compuesto por lignina, hemicelulosa y celulosa, en proporciones que varían según la especie de planta de donde proviene 7. La celulosa es un polisacárido no ramificado formado por moléculas de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos β-1,4 7-9. Una característica importante de la celulosa es su estructura cristalina que dificulta su degradación 10. Las hemicelulosas son polisacáridos heterogéneos, contienen habitualmente glucosa o xilosa, que presentan una cadena principal relativamente larga con ramificaciones cortas. Algunos polisacáridos representativos de las hemicelulosas son: xilanos, mananos, glucomanos, galactoglucomananos y xiloglucanos 9. Por último, la lignina se une a la celulosa y a la hemicelulosa dando soporte estructural, impermeabilidad y resistencia contra el ataque microbiano y el estrés oxidativo 7. La lignina es un polímero amorfo, no soluble en agua y ópticamente inactivo, formado por restos fenilpropanoides, derivados de los alcoholes cumarílico, coniferílico y sinapílico, unidos entre sí por enlaces éter 7-9. Dada su estructura compleja, para convertir esta biomasa vegetal en productos útiles, son necesarios una gama de tratamientos termoquímicos, hidrotérmicos y/o biológicos11. La sacarificación de esta biomasa implica la operación secuencial de un grupo de enzimas producidas por una variedad de bacterias y hongos. Por ejemplo, hongos aeróbicos mesofílicos y termofílicos (Trichoderma reesei, Penicillium pinophilum, Sporotrichum pulverulentum, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Sporotrichum thermophile, Thermoascus aurantiacus y Humicola insolens), bacterias aeróbicas mesofílicas y termofílicas (especies de los géneros Bacillus, Cellulomonas, Cellvibrio, Microbispora y Thermomonospora) y bacterias anaeróbicas mesofílicas y termofílicas (Acetivibrio cellulolyticus, Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens y Clostridium thermocellum) 7,8,12-14.La acción enzimática para llevar a cabo la hidrólisis de la celulosa implica la operación secuencial de un grupo de celulasas. Este sistema incluye tres tipos de enzimas; endo-1,4-β-glucanasa que ataca los enlaces β -1,4 en las regiones amorfas internas de la macromolécula generando largos fragmentos solubles (oligosacáridos), exo-1,4-β-glucanasa que separa el disacárido celobiosa desde los extremos de la molécula y β -glucosidasa que hidroliza la celobiosa con formación de glucosa 15. En cuanto a la degradación de la hemicelulosa, las enzimas involucradas son similares a las de la celulosa, sin embargo se requieren enzimas complementarias por su gran heterogeneidad. Por ejemplo, xilan-esterasas, ferúlico y p-cumárico-esterasas, a-1-arabinofuranosidasas y a-4-0-metil glucoronidasas, las cuales actúan sinérgicamente para hidrolizar eficientemente los xilanos y mananos. Adicionalmente, en los últimos años se ha reportado la importancia de las LPMOs (por sus siglas en inglés lytic polysaccharide monooxygenases) en la sacarificación de celulosa y hemicelulosa. Estas son metalo-enzimas que catalizan el clivaje oxidativo de enlaces (1-4)-glucosídicos en la superficie de diferentes tipos de polisacáridos 16,17. La degradación de la lignina es un prerrequisito para la hidrólisis de celulosa y hemicelulosa, que son las principales fuentes de energía para hongos y bacterias. Sin embargo, su estructura compleja y aleatoria, la hidrofobicidad y la carencia de enlaces fácilmente hidrolizables, hacen que la lignina sea difícilmente degradada por la mayoría de microorganismos. Los únicos microorganismos conocidos que transforman la lignina eficientemente hasta CO2 y H2O, son los hongos de la podredumbre blanca, de los cuales los más estudiados han sido Phanerochaete chrysosporium, Stropharia coronilla, Pleurotus ostreatus y Trametes versicolor 7,14,18,19. A diferencia de la degradación de residuos lignocelulósicos, los residuos orgánicos domiciliarios o industriales son más fácilmente degradables, ya que estos están compuestos por polímeros mayoritariamente amorfos y con menor grado de cristalinidad, como almidón, proteínas y lípidos. La hidrólisis de estos requiere de enzimas como α-amilasas, β-amilasas, glucoamilasas, lipasas, esterasas y proteasas, presentes en diversos grupos microbianos, entre los que se destaca el género Bacillus 20.Dentro de este contexto, el Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI) de la Universidad Javeriana, ha trabajado con microorganismos que puedan ser usados en la degradación de residuos orgánicos domiciliarios y/o residuos lignocelulósicos, ya sea para ser formulados como principios activos en bioinoculantes o para la producción de sus enzimas. Entre estos microrganismos se encuentra el aislamiento fúngico codificado como HC1, el cual fue identificado inicialmente como Penicillium sp. y posteriormente como Talaromyces sayulitensis (sin embargo, aún no se tiene certeza de su ubicación taxonómica). Este aislamiento fue obtenido a partir de un tamizaje de microorganismos con actividad lignocelulolítica en suelos rizosféricos de cultivos de arroz en los departamentos de Tolima y Meta 21 y ha mostrado una alta actividad celulolítica y especialmente xilanolítica sobre residuos como tamo de arroz 22, tallos de clavel 23, caña de azúcar (resultados sin publicar) y cascarilla de cebada 24. Por otro lado, en el año 2005 se obtuvieron 14 aislamientos del género Bacillus a partir de residuos sólidos orgánicos domiciliarios, los cuales presentaron actividad amilolítica y proteolítica. Estos aislamientos fueron utilizados como acelerantes del proceso de compostaje de residuos sólidos orgánicos domiciliarios, de plazas de mercado y biosólidos, entre otros; reduciendo 2 semanas el tiempo de proceso y obteniendo un producto de características físico-químicas y microbiológicas acorde con la NTC 5167/11. Adicionalmente, se demostró la eficiencia del compost obtenido en fertilización de cultivos de Stevia rebaudiana Bertoni, hortalizas y zanahoria, entre otros 25-28. Más recientemente, dos de estos aislamientos fueron utilizados en consorcio tripartito con el hongo Talaromyces sayulitensis HC1 en procesos de compostaje de mortalidad en granjas porcícolas, con resultados satisfactorios en reducción del tiempo y calidad del producto obtenido 29.En este proyecto de investigación se propone develar el potencial metabólico para la conversión de residuos orgánicos (domiciliarios o industriales y desechos lignocelulósicos) de Talaromyces sayulitensis HC1 y las cepas de Bacillus sp. CMPUJ 453 y CMPUJ 452, a través de la anotación funcional de sus genes, caracterización filogenómica y verificación de actividad enzimática in vitro. Hasta el momento se ha comprobado que estos aislamientos son capaces de degradar residuos domiciliarios y lignocelulósicos, lo que se ha relacionado con algunas actividades enzimáticas previamente determinadas. Sin embargo, aún se desconoce todo su potencial metabólico para la degradación de biomasa vegetal y residuos orgánicos. Debido a esto, develar el genoma de estas cepas permitirá acceder al conocimiento básico para entender el perfil genético y saber qué tipo de genes podrían estar involucrados y cuales son claves en los procesos de degradación de residuos orgánicos y especialmente residuos lignocelulósicos. Adicionalmente, este enfoque permitirá detectar genes candidatos claves en el proceso de degradación, los cuales podrán ser clonados y expresados para la posterior producción industrial de las enzimas. En este estudio, el análisis filogenómico, además de contribuir a develar el potencial metabólico, permitirá identificar con una mayor resolución la ubicación taxonómica de los aislamientos, lo cual es un requisito indispensable para la formulación futura de bioinoculantes. Finalmente, el análisis enzimático del secretoma permitirá conocer a profundidad la maquinaria enzimática para la degradación de diferentes tipos de sustratos que hasta el momento no han sido contemplados y que pueden encontrarse en diferentes tipos de residuos orgánicos. NOTA: Las referencias bibliográficas se encuentran como documento adjunto.