Reprogramación de linfocitos T CD8+ para aumentar su potencial antiviral contra la infección crónica por el HBV: explorando el papel de Nur77

DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO DE TESIS DOCTORAL El virus de la hepatitis B (HBV) puede causar infección crónica en humanos, lo que se conoce como hepatitis B crónica. Esta enfermedad es una importante problemática de salud a nivel mundial, ya que confiere un alto riesgo de muerte por cirrosis y hepatocarcinoma. Para el año 2019, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), al menos 296 millones de personas tenían hepatitis B crónica. Estos individuos requieren de terapia antiviral continua y de por vida, ya que actualmente no se dispone de una cura de esta infección. Por lo tanto, son necesarias nuevas estrategias terapéuticas enfocadas en la eliminación del virus, lo que llevaría a una remisión o curación de la infección. Precisamente, una alternativa inmunoterapéutica es la promoción o aumento de la capacidad antiviral de los linfocitos T (LT) CD8+, que son críticos en la defensa del humano contra microorganismos intracelulares, incluido el HBV (1). En estudios previos en el contexto de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), se desarrolló una estrategia para aumentar la funcionalidad de LT CD8+ específicos para este virus, aquí referida como reprogramación. Luego de la exposición de los LT CD8+ a una molécula que inhibe la quinasa GSK3 celular, estas células aumentan su capacidad de producción de citoquinas, proliferación, supervivencia y supresión viral (2). Esta estrategia inmunoterapéutica está siendo explorada en modelos in vivo de transferencia adoptiva para VIH (Figura 1). Un aspecto central por resolver en el contexto de infecciones virales crónicas es si esta estrategia de reprogramación es igualmente efectiva para potenciar la capacidad funcional de los LT CD8+ frente otros virus, como el HBV. Por lo tanto, en el marco de mi tesis doctoral, exploraremos la efectividad de esta estrategia de reprogramación de LT CD8+ en individuos con hepatitis B crónica. Específicamente, se evaluará el efecto de un inhibidor de GSK3 sobre el fenotipo y la funcionalidad (producción de citoquinas y proliferación) de los LT CD8+ HBV-específicos. Además, analizaremos si el perfil funcional de las células reprogramadas es similar al de las células de individuos que tuvieron infección por HBV pero lograron resolver espontáneamente la infección, y que se espera tengan una óptima capacidad funcional (3). Nosotros proponemos que las nuevas inmunoterapias combinadas dirigidas a curar la hepatitis B crónica (y potencialmente otras infecciones virales crónicas) deben involucrar la reprogramación de los LT CD8+ para potenciar su capacidad antiviral. Por lo tanto, los resultados de este proyecto aumentarán nuestro entendimiento sobre la eficacia y los mecanismos de reprogramación de LT CD8+ para aumentar su potencial antiviral, en la búsqueda de la remisión de infecciones crónicas prevalentes. Los siguientes son los objetivos de la tesis doctoral, y en la Figura 2 se muestra el diseño general del proyecto: Objetivo general Evaluar si la reprogramación con un inhibidor de GSK3 aumenta el potencial antiviral de LT CD8+ HBV-específicos de individuos con hepatitis B crónica. Objetivos específicos 1. Analizar el impacto de la reprogramación de los LT CD8+ de individuos con hepatitis B crónica sobre el fenotipo, la capacidad de supervivencia, proliferación, y producción de citoquinas. 2. Determinar si la reprogramación de los LT CD8+ de individuos con hepatitis B crónica potencia los efectos del bloqueo del receptor PD-1. Comparar la capacidad funcional de LT CD8+ reprogramados de individuos con hepatitis B crónica con el de células provenientes de individuos que resolvieron espontáneamente la infección por HBV. Dentro del primer objetivo, para evaluar las propiedades funcionales de los LT CD8+ HBV-específicos de individuos con hepatitis B crónica, emplearemos un ensayo en el que se estimularán los LT CD8+ con péptidos derivados de proteínas virales para posteriormente evaluar simultáneamente la producción de citoquinas, la capacidad de supervivencia, y la proliferación. Este ensayo de estimulación antígeno-específica ha sido ampliamente utilizado en nuestro laboratorio, y tengo igualmente tiene experiencia en esta técnica (4). No obstante, además de evaluar las propiedades funcionales de los LT CD8+ HBV-específicos, pretendemos explorar ciertos mecanismos moleculares asociados con un mayor o menor potencial antiviral. En este contexto, resultados preliminares de nuestro grupo de investigación han mostrado que el aumento en la capacidad de producción de citoquinas por LT CD8+ luego de la inhibición de GSK3 se asocia con una mayor expresión de Nur77 (Figura 3), un receptor nuclear que se ha visto implicado en la regulación metabólica de los LT CD8+ de memoria en modelos murinos (5,6). Sin embargo, la relación entre Nur77 y la funcionalidad de los LT CD8+ humanos no ha sido explorada, así como no es claro su papel en el contexto de la reprogramación con un inhibidor de GSK3. Con base en lo anterior, como parte del primer objetivo del proyecto de mi tesis doctoral, con la presente propuesta pretendemos explorar la relación entre la expresión de Nur77 y el perfil de diferenciación de los LT CD8+, así como con la capacidad funcional de células HBV-específicas reprogramadas o no con un inhibidor de GSK3. Los resultados de esta propuesta nos permitirán a) Entender la relación entre Nur77 y las funciones efectoras de los LT CD8+ humanos (7), en la búsqueda de los mecanismos moleculares asociados con su potencial antiviral; b) Avanzar en la búsqueda de nuevos blancos inmunoterapéuticos enfocados en aumentar la funcionalidad de los LT CD8+ para combatir infecciones crónicas; c) Avanzar en la optimización de los ensayos inmunológicos propuestos a desarrollarse durante mi proyecto de tesis doctoral; c) Fortalecer la capacidad técnica de nuestro laboratorio para futuros estudios inmunológicos en hepatitis B. Figura 1. Enfoque clínico propuesto para la transferencia adoptiva autóloga de LT CD8+ reprogramados, con el objetivo de promover la remisión de infecciones virales crónicas. Actualmente esta estrategia se está evaluando en modelos animales de VIH. Figura 2. Diseño experimental general del proyecto de tesis doctoral. De cada individuo con hepatitis B crónica o con resolución espontánea de la infección se tomará una muestra de sangre para hacer tipificación del HLA de clase I, así como para aislar células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Las CMSP serán empleadas para hacer estimulación con péptidos de HBV, en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-PD-1 (usando estimulación con anti-CD3/CD28 como control positivo). Luego de la estimulación, se evaluará el fenotipo, la capacidad de supervivencia, proliferación, y producción de citoquinas por LT CD8+ HBV-específicos. Figura 3. La expresión de Nur77 se asocia con el aumento de la funcionalidad de LT CD8+ reprogramados con un inhibidor de GSK3. Linfocitos T CD8+ humanos de individuos sanos fueron tratados con un inhibidor de GSK3, seguido de estimulación con anti-CD3/CD28 por 48 hs. A. Izquierda: expresión de Nur77 en LT CD8+. Derecha: Frecuencia de células Nur77+. B. Frecuencia de células IL-2+ TNF-a+ del total de células Nur77- y Nur77+. *P