Optimización del medio de cultivo para producción de la lacasas recombinante POXA 1B de Pleurotus ostreatus en Pichia pastoris

En los hongos, las lacasas están encargadas de una gran variedad de funciones fisiológicas, como son, morfogénesis, defensa, interacciones patógeno/hospedero con plantas y degradación de lignina [1. En general las lacasas de hongos son proteínas globulares monoméricas de aproximadamente 60 a 70 kDa con puntos isoeléctricos (pI) ácidos, cerca de pH 4; sin embargo, existen muchas excepciones. La mayoría de las lacasas de hongos son enzimas glicosiladas extracelulares, dichas glicosilaciones se encuentran en un rango de 10 a 25% y en algunos casos pueden estar por encima de 30% en peso [2. Las lacasas muestran un rango extraordinario de degradación de sustratos naturales (fenoles, polifenoles, anilinas, arildiaminas, metoxifenoles, hidroxiindoles, bencenotioles, compuestos metálicos orgánicos e inorgánicos, entre otros), esta es la razón de su gran atractivo para una variedad de aplicaciones biotecnológicas [3. Se han propuesto un gran número de aplicaciones para las lacasas en diversos sectores industriales, como son, textil, alimentos, papel y pulpa, farmacéutico, químico, nanobiotecnológico, cosmético, además de otros relacionados con biorremediación. Las lacasas secretadas de fuentes nativas generalmente no son adecuadas para su obtención a gran escala, esto se debe principalmente a los bajos rendimientos de producción y los altos costos de los procedimientos de preparación y purificación; sin embargo, la expresión heteróloga permite obtener rendimientos altos y producir lacasas en mayor cantidad para aplicaciones industriales. La expresión de proteínas recombinantes en hospederos de fácil cultivo y manejo, permite alta productividad y reduce los costos de producción. La versatilidad y las posibilidades de escalado en la producción de proteínas recombinantes abren nuevas oportunidades comerciales para sus usos industriales [4. Con el fin de producir mayores cantidades de proteína de alta pureza, recientemente se ha llevado a cabo la expresión de genes recombinantes de lacasas, en hospederos heterólogos, como son, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Yarrowia lipolytica y Trichoderma reseei [5. En este sentido, el uso de sistemas de expresión constitutiva en levaduras ha sido muy útil, así como el uso de promotores fuertes como el GAP. El promotor constitutivo (pGAP) gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa de la levadura Pichia pastoris fue aislado por primera vez en 1997 [6 y se ha usado para la expresión de muchas proteínas heterólogas usando glucosa o glicerol como sustratos de crecimiento sin la necesidad de un control en demasía estricto del proceso o los problemas de seguridad asociados con la adición de metanol y la regulación inducible de la expresión [7. En un proyecto en ejecución (próximo a terminar en julio-2014) el grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial, logró la expresión de la lacasa recombinante POXA 1B de Pleurotus ostreatus en Pichia pastoris bajo el control del promotor GAP [8. En este proyecto de continuidad se propone la optimización de los factores: concentración de nitrógeno y tipo de fuente (orgánica o inorgánica), concentración de carbono y mejor fuente (glucosa, fructosa o glicerol), concentración de cobre, transferencia de oxígeno, tiempo de cultivo y porcentaje de inóculo, con el objetivo de aumentar la actividad específica de esta lacasa recombinante a baja escala de producción y generar un medio de cultivo optimizado que sirva para comenzar los estudios de cambio de geometría y posterior escalado.