Obtención y caracterización de lipasas producidas por bacterias aisladas de macroalgas marinas y muestras de suelo de glaciar

Actualmente, la hidrólisis enzimática se ha visto como una alternativa prometedora frente a los métodos de extracción y purificación convencionales (Martin et al. 2014). En el año 2017, el mercado industrial de las enzimas estuvo valorado en US $6.1 billones y se espera que alcance los US $ 8.5 billones para el 2022. Esta economía creciente, ha promovido la búsqueda y obtención de biocatalizadores novedoso, así como la generación de patentes, en aplicaciones relacionadas con la industria farmacológica, textil, médica y de alimentos (Trincone, 2011).La búsqueda de nuevas enzimas está enfocada en propiedades o funciones únicas tales como actividad a bajas temperaturas, termoestabilidad, adaptación a pH, tolerancia a alta salinidad, presión, solventes, iones metálicos e inhibidores, entre otros (Zang et al. 2018). En este sentido, los microorganismos que viven en hábitats con condiciones extremas de temperatura, pH, presión y altas concentraciones de sal, son una fuente promisoria de enzimas, que pueden retener su integridad y función bajo diferentes condiciones de reacción (Karpushova et al. 2005).Entre los biocatalizadores de mayor importancia, las lipasas se caracterizan por su amplia especificidad de sustratos, alta estéreo y regioselectividad, independencia de cofactores, además de presentar estabilidad en presencia de solventes orgánicos (Park et al. 2009; Pascoal et al. 2018). Debido a estas propiedades, las lipasas tienen potencial aplicación en múltiples procesos biotecnológicos relacionados con la producción de alimentos, así como en las industrias farmacéutica, de papel, detergentes, cosméticos y de síntesis química, entre otros (Ganasen et al. 2016).Las enzimas lipolíticas incluyen las esterasas y lipasas, que pertenecen a la clase general de hidrolasas de ésteres carboxílicos (EC 3.1.1), que catalizan la hidrólisis de enlaces éster. Las esterasas (EC 3.1.1.1) hidrolizan ésteres solubles en agua o ésteres emulsificados con ácidos carboxílicos de cadenas cortas (10 átomos de carbono) y las lipasas (EC 3.1.1.3) actúan en una interface agua-lípido, sobre ácidos grasos de cadenas largas conformados por más de 10 átomos de carbono (Gao et al. 2016).Las lipasas son sintetizadas por animales plantas o microorganismos; sin embargo, las obtenidas de bacterias y hongos son las de mayor interés, dado que presentan tiempos de generación más cortos, altas tasas de conversión de sustratos a productos, además de la versatilidad y facilidad existentes, en términos de producción de biomasa (Ganasen et al. 2016).En cuanto a las lipasas de origen microbiano, numerosas enzimas lipolíticas han sido obtenidas a partir de estudios metagenómicos o mediante expresión en sistemas heterólogos (Carissimi et al. 2007; Kim et al. 2010). Sin embargo; estas aproximaciones presentan ciertas limitaciones en cuanto al reconocimiento del promotor, los procesos de transcripción y traducción o las modificaciones post-traduccionales que tienen que ver con el plegamiento y secreción de las enzimas recombinantes (Gao et al. 2016; Lan et al. 2016). En este sentido, el enfoque relacionado con el cultivo de microorganismos, seguido de una selección de aislamientos que muestren la actividad objeto de investigación, se constituye en una herramienta importante en el estudio de nuevas enzimas (Hehemann et al. 2014). Así mismo, existe gran interés en la producción de lipasas sintetizadas por microorganismos cultivables, muchos de los cuales aún permanecen inexplorados (Ferrer et al. 2007; Li et al. 2016).Basados en los argumentos expuestos, esta propuesta de investigación está enfocada en el estudio de lipasas producidas por bacterias aisladas a partir de muestras provenientes de dos fuentes: macroalgas de la especie Ulva lactuca (U. lactuca), presentes en el litoral rocoso de la Punta de la Loma (Santa Marta) y un enriquecimiento microbiano de suelo de glaciar del Parque Nacional Natural los Nevados (PNN), ubicado en la Cordillera Central de Colombia.En el primer caso, la investigación tuvo como propósito estudiar la comunidad de bacterias epífitas de macroalgas de la especie U. lactuca presentes en el litoral rocoso de la Punta de la Loma, la cual no había sido descrita hasta este estudio. Para tal fin, se empleó una aproximación metagenómica, complementada con el estudio de bacterias cultivables aisladas de la superficie de esta macroalga para, en primer lugar, describir la comunidad de bacterias epífitas y en segunda instancia, evaluar su potencial en la síntesis de enzimas marinas (Comba et al. 2017).Dentro de los resultados obtenidos en este estudio, se destacan la descripción de los principales grupos que componen la comunidad de bacterias epífitas de U. lactuca, con base en el análisis del gen ARNr 16S de bacterias cultivables, así como de la fracción no cultivable (ADN metagenómico). Respecto a la búsqueda de enzimas producidas por bacterias epífitas, se aislaron cepas de la superficie macroalgal, las cuales fueron sometidas a un tamizaje preliminar para diferentes actividades enzimáticas (amilolítica, celulolítica, lipolítica y agarolítica) de interés para el estudio (Comba et al. 2018).A partir de esta aproximación, se obtuvieron aislamientos con actividad en los distintos sustratos evaluados, dentro de los cuales se encuentra una cepa identificada taxonómicamente como Bacillus xiamenensis, que mostró actividad lipolítica en medio con tributirina como sustrato, la cual se mantuvo estable a una temperatura de 4°C. Este resultado, se constituye en un hallazgo importante del estudio, teniendo en cuenta, que no existían registros de lipasas producidas por la fracción cultivable de bacterias epífitas de macroalgas marinas presentes en la región de Santa Marta (Caribe Colombiano) (Arnosti et al. 2014; Prabhawathi et al. 2014).La cepa de Bacillus xiamenensis se encuentra depositada en el Banco de Cepas y Genes del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia y también hace parte de la Colección de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana. Adicionalmente, se cuenta con las secuencias del genoma total de esta bacteria, las cuales una vez analizadas serán depositadas en la base de datos del Joint Genome Institute (JGI) https://genome.jgi.doe.gov/portal/.En el segundo caso, la investigación se enfocó en estimar la diversidad de bacterias lipolíticas cultivables en dos ecosistemas (Páramo y Glaciar) del PNN, para lo cual, se aislaron bacterias a partir de un enriquecimiento de muestras de suelo, en medios de cultivo con sustratos lipídicos. Posteriormente, a partir del análisis de restricción del gen ARNr 16S (ARDRA), se observó una mayor diversidad, en el enriquecimiento de la muestra de glaciar, representada por los géneros Pseudomonas, Stenotrophomonas, Ralstonia, Burkholderia y Aeromonas (Palacios et al. 2017).Como resultado de este trabajo, se obtuvo un aislamiento identificado taxonómicamente como Stenotrophomonas rhizophila, proveniente del enriquecimiento microbiano de suelo de glaciar del PNN, en el cual se identificó la producción y secreción de lipasas. El análisis cualitativo realizado en medios de cultivo suplementados con tributirina o aceite de oliva al 1% y a una temperatura de incubación de 20°C, evidenció la capacidad de hidrólisis de S. rhizophila, en los dos sustratos evaluados (Palacios et al. 2017). Por tratarse de la primera cepa de esta especie, aislada de suelo de glaciar, este se considera como un hallazgo importante del estudio y sirve como punto de partida para la generación de conocimiento relacionado con la producción de lipasas extracelulares producidas por esta bacteria (Hemachander et al. 2000; Bardgett et al. 2005; Joseph et al. 2008; Wang et al. 2008). La cepa S. rhizophila se encuentra depositada en la colección de microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana. Adicionalmente se cuenta con su genoma secuenciado, que se encuentra ensamblado y anotado y está depositado en el Joint Genome Institute (JGI) con el ID 2681812861.Posteriormente, tras los ensayos de caracterización preliminar de la enzima, se determinó su estabilidad en altas temperaturas (80°C) y pH alcalino (pH 9). Estos resultados, demuestran el potencial de los ambientes extremos como fuentes de enzimas con características funcionales de interés biotecnológico (Borda 2014). Con base en los resultados obtenidos en los dos estudios relacionados con el aislamiento de bacterias con actividad lipolítica, obtenidas de la superficie de macroalgas de la especie U. lactuca y de un enriquecimiento microbiano de suelo de glaciar del PNN, respectivamente, en esta propuesta se plantea una colaboración entre los grupos; Unidad de Investigaciones Agropecuarias y Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental de la Pontificia la Universidad Javeriana, Bioprocesos y Bioprospección de la Universidad Nacional de Colombia y MicroBio de la Universidad de los Andes, con la participación de los investigadores José Salvador Montaña, Sandra Baena y Natalia Comba de la PUJ, Dolly Montoya de la UN y Diego Jiménez de UniAndes.La propuesta está orientada a la obtención y caracterización de lipasas producidas por las cepas Bacillus xiamenensis y Stenotrophomonas rhizophila, aisladas de dos ambientes (macroalgas marinas y muestras de suelos de glaciar). El interés en estos aislamientos bacterianos se debe a su capacidad para producir lipasas activas a bajas y altas temperaturas y en condiciones de pH alcalino, características que resultan útiles en distintos procesos industriales y que no son comúnmente encontradas en microorganismos aislados de ambientes con condiciones no extremas de temperatura y salinidad (Su et al. 2016).