Modificadores Epigenéticos SIRT y su impacto en Cáncer y Senescencia celular: Control transcripcional de los genes p16INK4a y p21CIP.

La senescencia celular es un estado en que las células limitan su proliferación en respuesta al estrés, daño al ADN o de forma programada. Se describió inicialmente hace más de medio siglo, pero en los últimos años la investigación ha demostrado el papel clave de este proceso en diversos contextos fisiológicos, desde patologías como el cáncer o la fibrosis, hasta el desarrollo embrionario (1). La activación de la senescencia provoca, en primera instancia, que la célula deje de dividirse y, eventualmente, puede llevar a su eliminación mediada por el sistema inmune (1). Hoy sabemos que el equilibrio celular, en una gran variedad de situaciones fisiológicas y patológicas, depende en gran medida del correcto funcionamiento de la senescencia celular. Por tal motivo, errores en este equilibrio, por exceso o por defecto, pueden tener consecuencias dramáticas, como malformaciones durante el desarrollo o la formación de tumores (1). El cáncer es una enfermedad que se caracteriza por la proliferación descontrolada de las células de un tejido específico, las cuales tienen capacidad de invadir y destruir éstos y otros tejidos por la formación de neoplasias (2). Esta patología se origina a partir de la desregulación de los mecanismos homeostáticos celulares, que conllevan a que las células puedan alterar el ciclo celular y evadir las rutas de apoptosis (2). Los inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (CDKIs) son proteínas que regulan el ciclo celular en mamíferos mediante su interacción con otras proteínas regulatorias como las ciclinas (Cyc) y las quinasas dependientes de ciclinas (CDK) (2). En general, el complejo formado por Cyc y CDK promueve la proliferación celular mientras que la interacción de éste complejo con CDKIs conduce a la detención del ciclo. Estos reguladores inhibitorios se dividen en dos grandes familias: CIP/KIP donde se incluyen a p21 (CIP), p27 y p57; y la familia INK4 la cual incluye a p16, p15, p18 y p19 (3). Los miembros de la familia CIP/KIP se unen a los complejos CyC/CDK mientras que los miembros de la familia INK4 se unen a CDK-4 y CDK-6 en ausencia de Cyc (3). Se ha demostrado que sobre-expresión de cualquier CDKI provoca una detención en la fase G1 del ciclo celular, evitando la entrada de las células a la fase S. Esta detención se acompaña de la mantención del estado hipofosforilado y activación de la proteína del retinoblastona (pRB) (3). Estas propiedades biológicas y bioquímicas de estos CDKIs indican que pueden ejercer funciones importantes en diferentes contextos celulares e incluso patológicos (4). Se ha reportado que P16INK4a aumenta su expresión durante el envejecimiento en murinos y humanos, siendo descrito como uno de los principales factores de senescencia (5). Contrariamente, en cáncer se ha establecido que la inactivación de P16INK4a cumple un papel fundamental en la alteración del ciclo celular, detectándose inactivaciones en neoplasias como glioblastomas, cáncer de seno, pulmón y cólon entre otros (5). El gen p21CIP se ubica en el cromosoma 6 (6p21.2) en humanos y sufre splicing alternativo generando 5 variantes que codifican para 2 distintas isoformas de 18 y 22 kDa. Esta proteína se une e inhibe la función de los complejos ciclina CDK2, CDK1 y CDK4 actuando como regulador negativo del ciclo celular en fase G1 y S (6). Se ha descrito que p21CIP puede tener efecto dual en cáncer, ya que se ha observado que oncogenes lo reprimen para evitar que detenga el ciclo celular perjudicando el crecimiento del tumor. Sin embargo, se ha descrito también que p21CIP es un inhibidor de la apoptosis, mecanismo mediante el cual favorecería la supervivencia tumoral. Este resultado se identificó en células de musculatura lisa, donde se observó que al sobre-expresar p21CIP se incrementó la proliferación celular (7; 8). Por otro lado, se han detectado deleciones de p21CIP en cáncer de pulmón de células no pequeñas y en otro tipo de gliomas (9). Estos antecedentes nos permiten plantear que si bien la senescencia celular y el cáncer parecen procesos opuestos tienen mecanismos moleculares comunes como la acumulación del daño del ADN, la inestabilidad genómica, la presencia de mutaciones y/o desregulación de genes involucrados con el ciclo celular como p21CIP y p16INK4a (2). De los mecanismos epigenéticos que regulan la expresión de p16INK4a se ha establecido que la presencia de modificaciones covalentes en los residuos de las histonas de su promotor, es un evento fundamental para su control transcripcional (10). En estos casos se ha detectado, por ejemplo, enriquecimiento en los niveles de acetilación global de las histonas H3 y H4 en células que han iniciado el proceso de senescencia (1). En cáncer la represión de p16INK4a está relacionada con la presencia de mutaciones y/o de mecanismos epigenéticos asociados como presencia de modificaciones represoras en las histonas y metilación del ADN (11). De igual manera para la regulación transcripcional de p21CIP se ha establecido que la modificación covalente de histonas es un proceso fundamental, aunque se requieren de investigaciones adicionales para confirmar estos hallazgos (8). Uno de los mecanismos epigenéticos más estudiados y asociados a la represión transcripcional es la remoción de la acetilación de histonas, marca activadora (10). Esta actividad es catalizada por enzimas con actividad deacetiltransferasa denominadas HDACs (Hystone Deacetylase). Las proteínas SIRT pertenecen a la familia de las HDACs y se ha descrito que su expresión en diferentes órganos difiere en respuesta a procesos de senescencia y cáncer (10). En el presente proyecto se pretende evaluar la contribución de las proteínas SIRT1, 2, 6 y 7, que son las que presentan acción sobre las histonas, como reguladores transcripcionales de los genes p21CIP y p16INK4a en procesos de senescencia y cáncer. La ejecución de ésta propuesta investigativa será un aporte al conocimiento de estos dos procesos y a futuro podría contribuir con la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos en Cáncer. Por muchos años se ha considerado a la senescencia como un mecanismo supresor tumoral, debido al efecto protector contra el cáncer que ejerce en organismos jóvenes, en caso de activación de oncogenes o de inactivación de genes supresores tumorales (4). El entendimiento de los mecanismos epigenéticos que controlan este proceso podría ser de gran utilidad para la búsqueda de blancos terapéuticos y mejoras en el tratamiento de los pacientes con enfermedades oncológicas. Desde el año 2014 el Hospital Universitario San Ignacio, el Centro Javeriano de Oncología y la Pontificia Universidad Javeriana, constituyeron el grupo de trabajo interdisciplinario: ¿Unidad Funcional de Cáncer de Pulmón¿. Este grupo está conformado por oncólogos, neumólogos, radioterapeutas, cirujanos de tórax, patólogos, radiólogos, genetistas, enfermeras y paliativistas. Su objetivo principal es responder en forma temprana y eficiente a las necesidades de los pacientes con cáncer de pulmón, ofrecer el mejor tratamiento integral y acompañamiento, brindar educación, docencia y generar investigación traslacional basada en los problemas identificados en nuestra población. A partir de este grupo interdisciplinario surgió la necesidad de establecer líneas de investigación dirigidas hacia la búsqueda de nuevos biomarcadores de diagnóstico y pronóstico de la enfermedad. Consecuentemente, desde el año 2014 nuestro grupo de investigación transdisciplinar ha venido trabajando en tres proyectos de investigación relacionados con epigenética y su relación con el cáncer pulmonar. Específicamente analizando los mecanismos de regulación transcripcional de algunos genes identificados como potenciales marcadores en cáncer. De otra parte, desde el año 2016 hemos creado un vínculo investigativo con el laboratorio de Epigenética y Senescencia de la Facultad de Medicina y Ciencia de la Universidad San Sebastián (Santiago de Chile) que se ha visto reflejado en la ejecución de la Unidad de Investigación de un estudiante de pregrado en Bioquímica: ¿Rol de las sirtuinas 6 y 7 en la regulación transcripcional de p16INK4a y p21CIP en células de cáncer pulmonar¿ (12). En éste trabajo se evaluaron los perfiles de expresión de RNAm/proteína de p16INK4a y p21CIP, SIRT 6 y SIRT 7 en muestras provenientes de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549. Los resultados preliminares de éste trabajo permitieron evidenciar una baja expresión de p16INK4a (RNAm y proteína) y altas expresiones de p21CIP en células de adenocarcinoma pulmonar, A549 (figura 1 y 2). Respecto a la valoración de la expresión de las sirtuinas 6 y 7 a nivel de RNAm y proteína, se pudo establecer que existe un aumento en la expresión en células tumorales de pulmón A549 al compararlas con una línea de neuroblastoma. Esto podría estar relacionado con una implicación funcional en su mecanismo regulatorio a nivel transcripcional, sin embargo para confirmar estos hallazgos se requiere ampliar los análisis moleculares, involucrar otras líneas celulares tumorales de pulmón y otros tejidos; y finalmente realizar ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina que nos permitan evidenciar la unión de las SIRT en los promotores, que es lo que se plantea realizar en este proyecto. En este mismo contexto, esperamos que de las Sirtuinas que muestren unión o afinidad a los promotores de los genes referenciados realizar ensayos de pérdida de función mediante shRNA para confirmar su función reguladora. Estos procedimientos permitirán establecer el papel de las sirtuinas 1, 2, 6 y 7 en la regulación transcripcional de genes relacionados con procesos de senescencia y tumorogenicidad.