Implementación de un protocolo para la determinación de la actividad catalítica de enzimas lisosomales en muestras de sangre seca

Las enfermedades de depósito lisosomal (EDL) constituyen un grupo de alrededor de 50 errores innatos del metabolismo causados por mutaciones en proteínas lisosomales o proteínas involucradas en el proceso de biogénesis lisosomal. Estas enfermedades se caracterizan, desde el punto vista bioquímico, por la acumulación intralisosomal de sustratos parcialmente degradados. La incidencia global de este grupo de patologías se estima en 1:5.000 recién nacidos vivos, aunque las incidencias individuales oscilan entre 1:60.000 hasta 1:1¿000.000 [1]. Las EDL más frecuentes son debidas a la deficiencia de una hidrolasa lisosomal, de tal manera que su diagnóstico se basa en la determinación de la actividad catalítica de la proteína involucrada. Dicha actividad se considera como prueba confirmatoria cuando se emplean muestras celulares (usualmente obtenidas a partir de sangre periférica)[2]¿[4] . La obtención de muestra celulares a partir de sangre venosa presenta diferentes tipos de dificultades como las asociadas a la toma de muestra que implica una punción venosa que resulta molesta y difícil especialmente en niños, además de requerir volúmenes altos (se necesita obtener entre 5 y 10 ml de sangre venosa). A lo anterior se suma la dificultad en la conservación y transporte de la muestra, que generalmente implica conservar una temperatura específica (4°C) y evitar demoras y retrasos en el procedimiento. Adicionalmente, la muestra de leucocitos obtenidos a partir de sangre total, es una muestra de estabilidad limitada ya que la viabilidad celular se va perdiendo con el tiempo, ocasionando la posible aparición de falsos positivos (valores compatibles con enfermedad en individuos sanos)[5]. Por otra parte, las determinaciones enzimáticas in vitro están sujetas a diversas circunstancias, propias de la muestra y de las condiciones analíticas de cada laboratorio, que resultan en variaciones en los valores obtenidos (entre muestras y laboratorios), aun tratándose de individuos normales, por tanto, es fundamental que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia y la capacidad de detectar individuos afectados[6].Teniendo en cuenta lo anterior la muestra de sangre seca sobre papel de filtro (DBS por las siglas en inglés ¿Dried Blood Spot¿) surge como una alternativa viable, ya que requiere de pocas cantidades de muestra (60 µl de sangre por mancha, máximo 3 manchas por individuo), su conservación y transporte no necesitan condiciones especiales y los resultados obtenidos generalmente tienen altos grados de certeza permitiendo realizar una selección inicial de aquellos individuos a los cuales debe realizárseles la prueba definitiva en células o la evaluación molecular del gen[3], [4]. Disponer de técnicas sensibles, específicas y de fácil realización es de gran importancia para permitir un diagnóstico oportuno y tratar de minimizar al máximo la odisea diagnóstica a la que se ven sometidos los pacientes. A esto se suma la necesidad de realizar diagnósticos tempranos dada la creciente disponibilidad de nuevas terapias para EDL y la necesidad de administrar dichos tratamientos antes de que se presenten las complicaciones neurológicas comunes en este tipo de desórdenes. En este contexto, el algoritmo diagnóstico para la mayoría de las EDL para las que hay disponible terapia de reemplazo enzimático incluye cada vez más la determinación inicial de la actividad enzimática en sangre seca sobre papel de filtro como método de tamiz para determinar aquellos casos en que se haga necesario y relevante la determinación confirmatoria en células (leucocitos o fibroblastos) y/o el diagnóstico molecular.En Colombia las determinaciones en DBS están disponibles de forma muy limitada. Teniendo en cuenta las ventajas de utilizar DBS como prueba de tamiz inicial, se propone implementar protocolos para la determinación de la actividad catalítica de Beta-glucuronidasa (GUSB), Beta-galactosidasa (BGAL) y Beta-Hexosaminidasa (HEXO) en muestras de papel de filtro y establecer los valores de referencia propios para poder poner a disposición de la comunidad médica este tipo de herramienta diagnóstica. Esta técnica permitirá complementar la batería de evaluación bioquímica del instituto de errores innatos, ya que este cuenta con las pruebas confirmatorias (determinaciones enzimáticas en leucocitos) para estas enzimas. Este desarrollo permitirá la transferencia de la tecnología al portafolio de servicios clínicos del Hospital Universitario San Ignacio, contribuyendo a mejorar la aproximación diagnóstica a este grupo de patologías especialmente en pacientes de fuera de Bogotá.