EVALUACIÓN DE UNA MUTACIÓN RECURRENTE DEL GEN FAM20A ASOCIADA A AMELOGENESIS IMPERFECTA HIPOPLÁSICA Y SU EDICION POR CRISPR CAS EN UN MODELO ORGANOIDE DE AMELOBLASTO GENERADO CON CÉLULAS HIPSCS

La Amelogénesis imperfecta (AI)(MIM#301200), son desordenes congénitos que afectan la estructura del esmalte dental en su calidad y cantidad, en ambas denticiones. Esta se debe a mutaciones en los genes que están involucrados en la formación de las proteínas del esmalte (1). Los pacientes que la padecen experimentan sensibilidad a los estímulos térmicos, así como a lo dulce y salado de los alimentos, lo que deriva en problemas de desnutrición y en hábitos de higiene oral deficientes, conduciendo a un desarrollo rápido de la caries y de la enfermedad periodontal. Además, estos individuos sufren de problemas psicológicos y son víctimas de bullying, debido a su baja autoestima y a la apariencia de sus dientes (2,3) La AI ha sido clasificada de acuerdo con su apariencia clínica y radiográfica en: tipo I hipoplásico: esmalte delgado con fosas y ranuras, de color amarillo a café. Tipo II hipomadurativo: esmalte moteado blanco, blando y poco translucido. Tipo III hipocalcificado: esmalte poco mineralizado, generando desgastes en superficies de contacto de los dientes y Tipo IV hipomadurativo-hipoplasico con taurodontismo: una combinación de estos dos fenotipos asociado a presencia de coronas grandes y raíces cortas (taurodontismo) (1,4,5). En cuanto a su modo de herencia se clasifica en: autosómica dominante, autosómica recesiva y ligada a X (2). Su prevalencia varía entre 1:2.000 y 1:18.000 (6,7), con una frecuencia estimada de 0.5 % o menos, lo cual la categoriza como una enfermedad rara. En Colombia, un estudio retrospectivo reportó una prevalencia del 0.6 % (8). Otros estudios han asociado la AI con alteraciones dentales como dens in dente, taurodontismo, erupción ectópica o tardía, calcificaciones pulpares, reabsorciones coronales y radiculares en dientes no erupcionados, así como con anodoncia (ausencia congénita de dientes). También se han descrito alteraciones craneofaciales; como mordida abierta anterior, mordida cruzada y algunos casos de mordida profunda y retrognatismo mandibular (9-12). Así mismo, la AI se ha relacionado con varios síndromes como: el síndrome trico-dento-óseo (OMIM #190320) (12,13), el síndrome de jalili (OMIM #217080) (14), y el síndrome esmalte-renal entre otros (15). Este último clasificado como AI tipo IG (OMIM #204690), donde se presentan mutaciones bialélicas que causan una pérdida de la función en el gen FAM20A (OMIM*611,062) ocasionando AI hipoplásica, asociada al síndrome de fibromatosis gingival (hiperplasia gingival e hipertrofia de folículos de los gérmenes dentales) (16) y problemas renales, entre ellos la nefrocalcinosis (17). Otras mutaciones en el mismo gen están asociadas a la forma autosómica recesiva de AI hipoplásica (18). El gen FAM20A se expresa en ameloblastos, odontoblastos, células epiteliales renales, glándulas salivales y tejido gingival, entre otros. Está ubicado en el cromosoma 17q24.2 y consta de 11 exones (cDNA 1.626 pb que codifican para una proteìna de 541 aminoácidos) (19) Esta proteìna FAM20A es una pseudoquinasa que interactúa con FAM20C formando un complejo que potencia la fosforilación de proteínas secretadas esenciales para la mineralización dental (20). Estudios topológicos han demostrado que FAM20A es una proteìna transmembrana tipo II, con un dominio carboxi-terminal orientado hacia el lumen de organelos intracelulares y que desempeña un papel clave en la homeostasis gingival (16,20). Investigaciones recientes la han ubicado en la red cis-Golgi de ameloblastos y odontoblastos (21). La evidencia en modelos humanos y animales sugiere que FAM20A y FAM20C se coexpresan en el ameloblasto durante la formación del esmalte y en el odontoblasto durante la formación de la dentina. Los ameloblastos son células epiteliales secretoras del esmalte que derivan de células madre epiteliales (21,22), sufren apoptosis precoz antes de la erupción dental, por lo que el esmalte no puede repararse ni regenerarse (22–24). Este hecho limita la disponibilidad de estos, para estudiar sus mecanismos de diferenciación (25). Estudios recientes han demostrado que las células madre pluripotenciales inducidas humanas (hiPSCs) derivadas de células epiteliales dentales, pueden diferenciarse en ameloblastos mediante la modulación de la señal de la Proteína Morfogénica ósea BMP, que regula el mantenimiento y proliferación del epitelio dental (26-28). Kwa-ha et al 2023 (29) desarrollaron un protocolo en cultivo 3D, que permitió la diferenciación de hiPSC en organoides de ameloblastos tras 40 días de cultivo.Estos organoides presentan características similares a los ameloblastos y podrían utilizarse como modelos para el estudio de enfermedades dentales y de regeneración dental. Los organoides son estructuras celulares tridimensionales (3D), autoorganizadas y autorenovables in vitro, similares a órganos que reproducen características estructurales y funcionales de los órganos in vivo, incluyendo la composición celular y la arquitectura tisular. La capacidad de manipular genéticamente estos modelos representa una gran oportunidad para el desarrollo de aplicaciones terapéuticas (30). Una de las herramientas más prometedoras para esta manipulación, es la edición génica por CRISPR-Cas9, una nucleasa de ingeniería que permite modificar el ADN con alta precisión, rapidez y eficiencia. En bacterias funciona como un sistema inmune adaptativo utilizando un ARN guía (ARNg) para dirigir la nucleasa Cas hacia ADN exógeno, al cual inactivan mediante cortes específicos (31). La modificación de este ARNg permite desactivar genes específicos o, mediante el uso de una molécula de ADN donante, introducir cambios en regiones puntuales del genoma (32). Este sistema ha posibilitado la edición dirigida de genes en células humanas, tanto en Knockout como en Knock-in. Una vía eficiente de administración de sus componentes, es la electroporación de ribonucleoproteínas (RNP) Cas-9, que combina ARNg sintético y proteína Cas9 evitando el uso de vectores virales y reduciendo riesgos de integración genómica. Esto ofrece posibles ventajas en términos de seguridad para futuras aplicaciones clínicas (33). Estudios recientes, han demostrado el potencial terapéutico de CRISPR-Cas9 en casos como la interrupción del virus de la hepatitis B (34), la prevención de la distrofia muscular en modelos murinos (35) y la corrección de mutaciones en el gen CFTR en organoides de células madre intestinales de pacientes con fibrosis quística (36), entre otros. En un estudio clínico-molecular previo realizado por nuestro grupo de investigación (37), se analizó el exoma (WES) de 7 familias colombianas con AI, secuenciando regiones diana de 19 genes asociados a esta enfermedad. Se identificó en una de las familias una variante patogénica recurrente (16) c.907_908del p. (Ser303Cysfs*76) en el exón 6 del gen FAM20A, asociada a AI hipoplásica y al síndrome de fibromatosis gingival. Este es el primer reporte en Colombia de dicho síndrome, con correlación genotipo-fenotipo, en una paciente de 12 años. Sin embargo, aún se desconoce cómo esta mutación afecta funcionalmente la proteína FAM20A y su impacto sobre los ameloblastos. Por lo que en esta investigación se plantea, realizar un estudio funcional de la mutación recurrente c.907_908del p. (Ser303Cysfs*76) en el gen FAM20A, utilizando un modelo organoide de células ameloblasticas, generado a partir de células madres pluripotenciales inducidas humanas (hiPSCs). En dicho modelo, se introducirá la mutación original y posteriormente la editada, mediante la técnica CRISPR/Cas9 y se evaluaran sus efectos sobre la morfología, viabilidad y capacidad de mineralización del ameloblasto. Este proyecto proporciona no solo un enfoque integral para estudiar el impacto funcional de la mutación sino también explorar estrategias de corrección génica como posible terapia para amelogénesis imperfecta hipoplásica. La pregunta de investigación que se formula por consiguiente es: ¿Cuáles son los efectos de la mutación recurrente c.907_908del p. (Ser303Cysfs*76) del gen FAM20A asociada a amelogénesis imperfecta hipoplásica y de su edición, mediante CRISPR/cas9, sobre la morfología, viabilidad y capacidad de mineralización en un modelo organoide de ameloblasto generado a partir de células hiPScs?