Evaluación de nanopartículas como vehículo de entrega de proteínas de interés terapéutico al Sistema Nervioso Central en un modelo in vitro de Barrera Hematoencefálica

Los Errores Innatos del Metabolismo son enfermedades causadas por el daño en la funcionalidad de una proteína involucrada en el metabolismo de proteínas, carbohidratos, lípidos o nucleótidos. Este daño interrumpe el curso normal de una ruta metabólica específica lo cual genera la acumulación de sustratos a nivel celular causando alteraciones que generan cuadros clínicos diferentes que pueden ir desde cuadros clínicos severos de manifestación sistémica hasta enfermedades que afectan del Sistema Nervioso Central (SNC) [1. . Dentro de los EIM encontramos las enfermedades de depósito lisosomal (EDL), desórdenes que conllevan a la acumulación de sustratos tales como proteínas, glicosaminoglicanos (GAGs), carbohidratos o lípidos en el lisosoma [2. Diversas aproximaciones terapéuticas como la terapia génica, inhibición de sustrato, terapia de reemplazo enzimático (TRE) entre otras, han sido el foco de múltiples investigaciones para mejorar la calidad de vida de los pacientes, sin embargo, muchas de ellas muestran limitaciones que impiden su efectivo funcionamiento [3. Para las EDL la TRE ha sido una de las terapias más investigadas y se ha constituido como la principal alternativa de tratamiento en la actualidad. La TRE proporciona vía intravenosa (i.v) la enzima deficiente en el organismo para disminuir los niveles del sustrato acumulado en las células [4. Durante años, diversos sistemas de expresión han sido evaluados para la producción de las enzimas de interés terapéutico, entre ellos células de mamífero, plantas o insectos, y microorganismos, siendo las células de mamífero la más efectiva [5-8. Sin embargo, los microorganismos se han constituido como un sistema de expresión eficiente y de bajo costo que ha permitido obtener enzimas humanas recombinantes con características bioquímicas muy semejantes a las humanas [6, 9. A la fecha la TRE ha sido aprobada para diversas EDL mostrando logros en la disminución del acúmulo de sustrato en diferentes tejidos, reduciendo el tamaño de órganos afectados como el hígado y el bazo, mejorando la capacidad cardiaca y pulmonar, entre otros[4. Sin embargo, en aquellas que cursan con afectación del SNC no ha mostrado resultados alentadores debido a la dificultad para lograr que la proteína pase a través de la barrera hematoencefálica (BHE); como es el caso de las Gangliosidosis GM2 (Tay Sachs y Sandhoff). Algunos ensayos realizados en ratones mediante la inoculación intracerebroventricular (ICV) de una Hexosaminidasa-B recombinante modificada y producida en células de ovario de Hámster Chino (CHO), mostraron la reducción de los gangliósidos acumulados en la parénquima [10. Sin embargo, este tipo de administración requiere de procedimientos invasivos y con alto riesgo de complicaciones postoperatorias. Por tanto, se ha visto la necesidad de buscar nuevas alternativas que permitan mejorar el paso de la enzima de interés a través de la BHE tras su administración intravenosa. Una alternativa que está siendo evaluada en los últimos años es el uso de un amplio rango de nanopartículas de diferente naturaleza para la entrega de moléculas de interés terapéutico (fármacos, ácidos nucleicos y proteínas) al SNC [11. Las nanopartículas son vehículos coloidales de diverso tamaño (1-300nm) que incluyen una gran variedad de materiales que puedan ofrecer una administración eficiente a través de la BHE, proteger la molécula de interés de la degradación enzimática, ser estable en circulación, permitir la liberación autorregulada del fármaco, ser poco inmunogénico, ser biocompatible y biodisponible [11. Se han realizado pocas aproximaciones en el uso de vehículos terapéuticos para el tratamiento de EDL, un ejemplo fue el uso de nanopartículas de XXX para conducir albúmina como proteína modelo al cerebro de ratones con MPSI y II, sin embargo para el caso de gangliosidosis GM2 no han sido reportados [12, 13. De esta forma, y aprovechando la experiencia de nuestro grupo de investigación en la producción de enzimas lisosomales recombinantes empleando microorganismos [14-20 y la experiencia del trabajo conjunto del Grupo de Ingeniería Biomédica y el Grupo de Investigación en Bioinstrumentación e Ingeniería Clínica (GIBIC) de la Universidad de los Andes en la realización de plataformas terapéuticas que emplean vehículos nanoestructurados magnéticos a los cuales se les conjugan componentes biológicos para hacer más efectiva la traslocación trasmembranal de la proteína de interés terapéutico sin generar la ruptura de la membrana celular [21, 22, este proyecto busca evaluar estrategias basadas en nanopartículas para lograr la entrega de hexosaminidasas lisosomales recombinantes al SNC. Para lograr este objetivo, las ß-N-acetilhexosaminidasas lisosomales recombinantes Hex-A y Hex-B serán producidas en Pichia pastoris GS115 como se reportó previamente. Posteriormente, diversas formulaciones de nanopartículas serán sintetizadas y caracterizadas para su posterior evaluación como vehículo de entrega de las proteínas recombinantes al SNC empleando un modelo in vitro de BHE. Los efectos sobre marcadores de inflamación y de activación de la autofagia también serán evaluados, debido a que tanto la acumulación progresiva de sustratos en la célula (en este caso gangliósidos) así como el uso de nanopartículas pueden causar la alteración de dichos procesos celulares. Los resultados de este proyecto permitirán dar un paso más en el establecimiento de una TRE eficiente para las Gangliosidosis GM2 mediante el uso de ß-N-acetilhexosaminidasas recombinantes producidas en levadura y abrirán paso para la posterior evaluación in vivo de aquellas formulaciones de nanopartículas que muestren una mayor eficiencia de entrega a través del modelo in-vitro de BHE. Adicionalmente, los resultados de este proyecto podrán ser extrapolados para el diseño de terapias para otras enfermedades con afectaciones en el SNC.