Estudio del proteoma de Cryptococcus neoformans en respuesta a condiciones de alta biodisponibilidad de Hierro y Cobre: en búsqueda de nuevas dianas terapéuticas.

En el pasado, las infecciones invasivas por hongos eran lo suficientemente raras para considerar que los esfuerzos en investigación farmacéutica debían dirigirse a esas patologías (1). Sin embargo, con el aumento en el número de pacientes inmunocomprometidos, ha implicado el aumento de infecciones fúngicas y el desarrollo de nuevos antifúngicos. A pesar de esto, existen debilidades en el espectro, potencia, seguridad y farmacocinética de algunos antifúngicos y el desarrollo de nuevos es complicado debido a la gran similitud entre las vías metabólicas y de señalización entre las células mamíferas y fúngicas (2). Por lo tanto, es indispensable el estudio de las diferencias entre las células humanas y fúngicas para el hallazgo de nuevos objetivos terapéuticos y el subsecuente desarrollo de nuevas moléculas (3). A nivel mundial aproximadamente un millón de casos de criptococosis se reportan cada año y cerca de 625.000 muertes son notificadas (4,5). La infección es generada por dos especies: Cryptococcus neoformans se asocia generalmente con infecciones en inmunocomprometidos, especialmente en cuadros de meningitis con tasas de mortalidad del 30-50% y Cryptococcus gattii asociado a individuos inmunocompetentes (6,7). Algunos estudios han descrito las manifestaciones clásicas y factores de riesgo en pacientes inmunocomprometidos en especial en pacientes con cáncer y VIH; en algunos casos reciben altas dosis de esteroides y es común los episodios de anemia con la terapia antiretroviral, el manejo nutricional de estos pacientes es complejo y la administración de suplementos férricos es frecuente, favoreciendo así infecciones por C. neoformans debido a la alta disponibilidad de micronutrientes donde se ha demostrado el fracaso de la terapia antifúngica entre un 57% al 85% en estos pacientes a pesar del tratamiento con anfotericina B (8¿10). Los micronutrientes en el humano son esenciales para el sistema inmunológico, nervioso, cardiovascular y es importante en el mantenimiento de la función inmune. El hierro es vital en procesos relacionados con el trasporte del oxígeno y la obtención de ATP, entre otros. El cobre es un metal de transición y un elemento vital de las reacciones redox en el mamífero ya que gana y pierde electrones con facilidad, lo que hace que se vuelva potencialmente tóxico (11). Además, este elemento es conocido por ser un reactante de fase aguda y se sabe que los pacientes con SIDA tienen altos niveles de cobre en la sangre, lo que plantea una desventaja frente a infecciones causadas por C. neoformans, donde se han descrito vías de regulación de este micronutriente, que de forma simultánea inducen la expresión de genes asociados a rasgos de virulencia del hongo (12). La captura de microelementos como el hierro y el cobre, en un proceso infeccioso por parte de la célula fúngica favorece la expresión de factores de virulencia, para lo cual los hongos expresan mecanismos de adquisición, los cuales inducen el desbalance de la homeostasis en su hospedador contribuyendo, además, en el deterioro de la respuesta inmunitaria, permitiendo así, establecer la micosis (13¿15). La competencia por estos nutrientes en el proceso infeccioso es un punto central en el establecimiento o no de una infección; donde una sutil regulación puede favorecer al microorganismo o al hospedero. En Cryptococcus spp., se han descrito mecanismos específicos que lo facultan para la obtención de micronutrientes (13,16). Entre hallazgos realizados sobre la influencia de cobre y hierro en la patogenicidad de esta levadura, se han descrito la activación de genes que regulan la síntesis de capsula y melanina, de enzimas tipo lacasa, activación de superóxido dismutasa (SOD1), entre otros factores. La función principal de la enzima Superóxido dismutasa (SOD), es proteger a las células del anión superóxido generado endógenamente, subproducto de la respiración aeróbica normal. SOD puede hacer un complejo con hierro, manganeso, cobre y zinc. Se ha observado que el complejo de SOD con cobre y zinc, ayuda a la homeostasis de C. neoformans para la formación capsular, melanización y una mayor resistencia a la fagocitosis (17¿19). La melanización en C. neoformans está catalizada por la lacasa, una difenoloxidasa asociada a la pared celular que acciona la oxidación de compuestos fenólicos como las catecolaminas, esto explica el tropismo de este microorganismo por el sistema nervioso central (SNC). La melanina favorece a la resistencia al estrés oxidativo dentro de los fagolisosomas de las células fagocíticas del hospedero, esto adicional a la evasión del reconocimiento por parte de la respuesta inmune del mismo (20,21). La lacasa se compone de cuatro iones de cobre y está asociada a la pared celular de C. neoformans, que acciona la oxidación de compuestos fenólicos como las catecolaminas (21). En la unidad de proteómica se ha investigado la relación del hierro y el cobre, con la capacidad patogénica de C. neoformans, resultados obtenidos producto de una beca de POSDOC- 2015, trabajo continuado actualmente por la estudiante de doctorado Nórida Vélez (becada por convocatoria Interna financiada por la Vicerrectoría de Investigación, PUJ 2017) mostraron que la preexposición de la C. neoformans a estos micronutrientes y posterior inoculación en un modelo invertebrado de Galleria mellonella, conduce a un aumento en la patogenicidad en cepas de baja virulencia. Se ha evaluado el efecto de hierro y cobre en cepas de alta y baja patogenicidad (H99 y JEC21 respectivamente), en la cepa H99 al día 10 pos- infección en el modelo de G. mellonella, en condiciones basales la mortalidad fue del 80%, mientras que, en condiciones de pre cultivo con 500µM de cobre ó con 50µM de hierro la mortalidad fue del 100%. En JEC21 a los 15 días pos-infección, en condiciones basales se obtuvo una mortalidad del 35% y en condiciones de pre-cultivo a 500µM de cobre ó 50µM de hierro la mortalidad fue del 60% y 100% respectivamente (manuscrito en preparación título: ¿Increase in the bioavailability of iron and copper, increases pathogenicity in Cryptococcus neoformans in Galleria mellonella¿). Así mismo, un análisis con MALDI.TOF, mostró cambios proteómicos en el citoplasma de C. neoformans pre cultivados con hierro y cobre. Por lo anterior mencionado, se desea elucidar los mecanismos que están regulando este aumento en la patogenicidad, así como los cabios observados en proteínas citoplasmáticas, para lo cual contamos con el apoyo de la Unidad de Interacción hospedador-Patógeno y la Unidad de Proteómica de la Universidad Complutense de Madrid. El estudio del proteoma, nos permitirá obtener información de las proteínas a través de la caracterización a gran escala de su abundancia, ubicación, predicción en modificaciones postraduccionales, identificar biomarcadores moleculares (22,23). Estos biomarcadores constituyen una gran promesa para medicina humana, que luego de ser validados biológicamente tienen el gran potencial de mejorar el diagnóstico, prevención, pronóstico y terapia de enfermedades en la práctica clínica. Este estudio pretende entonces, conocer el perfil de expresión de proteínas de C. neoformans tanto a nivel citoplasmático como en vesículas extra celulares, bajo concentraciones de hierro y cobre, con el objeto de encontrar proteínas centrales en la expresión de factores de virulencia, las cuales puedan convertirse en candidatas a nuevas dianas terapéuticas.