Estudio del efecto de hongos endófitos como elicitores para la producción de derivados de ácido benzoico en cultivos in vitro de Piper cumanense

Los productos naturales se han utilizado por miles de años para el beneficio de la humanidad ya sea como alimentos o como fuente de materias primas para diversos fines. Por ejemplo, a nivel medicinal son usados en el tratamiento y prevención de enfermedades, a nivel agronómico para el control de diversos tipos de plagas, en la industria alimentaria como colorantes y saborizantes, y en la industria cosmética como fragancias, colorantes y antioxidantes (Liu, et al., 2017; Zhou, et al., 2014). Los responsables de la actividad biológica de los productos naturales son los metabolitos primarios y secundarios, moléculas derivadas del conjunto de reacciones bioquímicas que ocurren en las células y que cumplen funciones vitales y adaptativas en los organismos. Particularmente, los metabolitos secundarios representan una amplia variedad de compuestos químicos que cumplen funciones ecológicas específicas, como lo son: protección frente a patógenos, atracción de polinizadores y dispersores de semillas y, producción de aleloquímicos que generan un efecto de inhibición o estimulación del crecimiento en los organismos receptores. Estos compuestos se suelen producir como respuesta a un estímulo que cause un estrés, bien sea de tipo biótico o abiótico. La producción de estos metabolitos depende de las características genéticas propias de cada especie y del tipo de estrés al que sea sometida, ocasionando como un mecanismo de respuesta la sobreexpresión algunos genes que codifican para la producción de las enzimas involucradas en la síntesis de metabolitos secundarios (Gong & Wang, 2015; Rai, et al., 2017; Verma & Shukla, 2015; Zandalinas, et al., 2018). Dentro de los productos naturales, las plantas son las más estudiadas debido a que forman parte de todos los ecosistemas y a que se han adaptado a diversos climas y condiciones del suelo, lo que les ha conferido la capacidad de producir millares de metabolitos secundarios con diversas aplicaciones. Sin embargo, a pesar de que muchas sustancias han sido aisladas e identificadas en distintos grupos de plantas, aún existen muchas a las cuales no se les ha realizado ningún tipo de estudio fitoquímico, razón por la cual varias de ellas pueden ser fuente de nuevos compuestos con potencial aplicación a nivel, farmacéutico, agroquímico y alimenticio, entre otros (Naeem, et al., 2017; Sharma, et al, 2016; Verma & Shukla, 2015; Zanuncio et al., 2016). Las investigaciones enfocadas en el estudio de metabolitos secundarios suelen presentar algunas limitaciones, entre las que se encuentran: obtención de metabolitos en bajas cantidades, procesos extractivos y de purificación en muchos casos costosos, y composición química de plantas en ocasiones muy variable y dependiente de factores genéticos, ontogenéticos y/o externos de cada especie. Dichos aspectos han dificultado el desarrollo de estudios científicos más específicos que permitan identificar sustancias con valor productivo para una aplicación particular, quedándose la mayoría de las investigaciones en etapas preliminares (Niranjana, et al., 2014; Yun et al., 2012). Algunas de las estrategias para solventar estas limitaciones son: domesticación de especies silvestres y tecnificación de los cultivos, diseño y desarrollo de métodos sintéticos, y el uso de estrategias biotecnológicas. Las herramientas biotecnológicas ofrecen una gran variedad de ventajas, entre las que se encuentran: posibilidad de tener rendimientos de producción de los metabolitos de interés superiores a los obtenidos a partir de plantas silvestres, producción permanente bajo condiciones controladas en cultivos libres de patógenos e independientes de condiciones climáticas, edafológicas y/o geopolíticas y, puede ser en algunos casos técnicas más rápidas, sencillas, eficientes y de menor costo frente a otras estrategias (síntesis química o extracción a partir de cultivos tecnificados) (Gandhi, et al., 2014; Liu, et al., 2013; Ochoa-Villareal et al., 2016). Entre las herramientas biotecnológicas se destacan las suspensiones celulares, las cuales se caracterizan por ser cultivos in vitro de células en medio líquido bajo agitación continua en la que se emplean células denominadas callo, donde dichos callos, de preferencia friables, son inducidos en laboratorio mediante la aplicación de reguladores de crecimiento que desencadenan selectivamente procesos morfogenéticos, fisiológicos y bioquímicos en los tejidos vegetales. En este tipo de cultivos se han utilizado varias estrategias para estimular la producción de metabolitos secundarios, tales como: adición de precursores, biotransformación y elicitación, siendo esta última la más utilizada y efectiva para inducir a gran escala la biosíntesis de compuestos de interés (Niranjana et al., 2014; Ochoa-Villareal et al., 2016; Pérez-Alonso & Jiménez, 2011). La elicitación hace referencia a la inducción de la biosíntesis de metabolitos mediante elicitores, los cuales son factores bióticos como microorganismos, extractos de hongos, oligosacáridos, compuestos químicos como jasmonato de metilo, ácido salicílico, ciclodextrinas, y/o abióticos como cambios de fotoperíodo, radiación y temperatura, entre otros. Estos elicitores estimulan receptores presentes en las células de las plantas y de esta manera, activan respuestas de defensa que pueden generar un aumento en la producción de ciertas enzimas implicadas en la obtención de determinados metabolitos secundarios (Narayani & Srivastava, 2017; Yue et al., 2016). Por ejemplo, cultivos celulares de Lithospermum erythrorhizon optimizados con elicitores como jasmonato de metilo, etileno, reguladores de crecimiento, entre otros, han mostrado una productividad de shikonina, pigmento muy utilizado a nivel industrial, de incluso 800 veces mayor respecto a plantas cultivadas. Suspensiones de Ammi majus elicitadas con extracto de la bacteria Enterobacter sakazaki han presentado un rendimiento 90 veces mayor respecto a suspensiones sin tratamiento en la producción de umbelliferona. Cultivos celulares de Gymnema sylvestre elicitados con extractos de los hongos endófitos Polyancora globosa y Xylaria sp. aumentaron 10 veces la producción de ácido gimnémico, compuesto con propiedades hepatoprotectivas y antiinflamatorias y útil para la reducción de lípidos. En suspensiones de Salvia miltiorrhiza elicitadas con ácido salicílico se observó un aumento de hasta 10 veces en la producción de compuestos fenólicos, estableciéndose que dichos cultivos podrían usarse para la obtención a gran escala de ácido salvianólico B y ácido cafeico (Netala, et al., 2016; Staniszewska, et al., 2003; Yazaki, 2017). En el cultivo de tejidos vegetales la relación que establecen las plantas con otros microorganismos como lo son los hongos endófitos, es aprovechada para inducir la biosíntesis de compuestos de interés, ya sea por respuestas mutualistas o de competición, encontrándose que el uso de hongos endófitos ha logrado inducir la producción de compuestos de interés en suspensiones celulares de plantas hasta 700 veces respecto del control (Pawar et al. 2011). Así mismo, se ha logrado establecer suspensiones en cultivo con hongos endófitos aumentando hasta 38 veces la producción de metabolitos secundarios (Li, Y et al. 2009). El equipo de investigación conformado en esta propuesta desde hace varios años ha enfocado sus investigaciones para realizar aportes al conocimiento químico y propiedades biológicas de especies de diferentes familias de plantas, entre las que se destacan la familia Piperaceae. Especies de esta familia están bien representadas en el país y se caracterizan por contener sustancias con significativa actividad biológica con potencial aplicación a nivel farmacéutico y agrícola (Celis, et al., 2008; Muñoz D. R., 2018). La familia tiene una distribución pantropical, comprende alrededor de 4600 especies, agrupadas en 13 géneros, siendo el género Piper el más representativo de la familia. Este género posee especies con metabolitos secundarios como amidas, derivados de ácido, flavonoides, fenoles prenilados, terpenos, lignanos, neolignanos, alquilfenoles, fenilpropanos, kawalactonas y derivados prenilados de ácido benzoico (Ladino, 2018; Parmar et al., 1997, Xu & Li, 2011). De las diferentes investigaciones que ha adelantado el equipo de investigación en especies del género Piper, se destaca el estudio sobre la especie Piper cumanense, de la cual se han aislado principalmente terpenos y derivados de ácido benzoico, donde estos últimos han presentado promisoria actividad antifúngica in vitro sobre los hongos fitopatógenos como Botrytis cinerea y Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Los extractos de esta especie también han exhibido actividad molusquicida contra caracoles adultos del género Biomphalaria y actividad antimalárica contra Plasmodium falciparum (FcB2) (Cañizares, et al., 2015; Garavito et al., 2006; Parra, et al., 2011; Parra, et al., 2013; Rapado et al., 2014). A pesar del gran potencial de los metabolitos secundarios presentes en P. cumanense, problemas relacionados con la baja cantidad de producción y extracción de estos metabolitos, han restringido la realización de ensayos de actividad biológica más específicos que permitan validar el uso de dichas sustancias, así como también pruebas a escala de invernadero y campo, en el caso de metabolitos de interés agrícola. Esta limitación en la síntesis de los metabolitos secundarios en cultivos in vitro, también afecta negativamente su producción a gran escala y su posterior aplicación. Por lo tanto, se hace evidente la necesidad de desarrollar estrategias que permitan obtener mayores cantidades de estos compuestos, y en este sentido el uso de microorganismos endófitos como elicitores es una alternativa interesante para explorar dado su gran potencial. Teniendo en cuenta lo anterior, esta propuesta tiene como objetivo contribuir a las investigaciones en la familia Piperaceae mediante la evaluación del efecto de los hongos endófitos de Piper cumanense para inducir la biosíntesis de derivados de ácido benzoico en cultivos in vitro de P. cumanense. Para lo cual el proyecto comprende el aislamiento e identificación de hongos endófitos. Paralelamente se caracterizarán las células en suspensión a partir de callos friables de P. cumanese y finalmente se evaluará el efecto de algunos hongos endófitos en la producción de derivados de ácido benzoico en cultivos in vitro de P. cumanense. Los resultados derivados del proyecto aportarán conocimiento básico acerca de la microbiota endófita de P. cumanense, y permitirán determinar condiciones favorables para cultivos celulares P. cumanese y la influencia de hongos endófitos en la producción de derivados de ácido benzoico en estos cultivos. Además, contribuirán al establecimiento de condiciones determinantes, necesarias para el escalamiento de la producción in vitro de metabolitos secundarios bioactivos, y así a largo plazo desarrollar plataformas de “factorías celulares” de metabolitos con diversas aplicaciones.