Establecimiento de un método de detección de glicosaminoglicanos mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas

Proyecto: Investigación

Detalles del proyecto

Descripción

Los glicosaminoglicanos (GAGs) son un grupo de polisacáridos lineales complejos que hacen parte de la matriz extracelular. Hasta la fecha se han descrito 5 GAGs: heparán sulfato (HS), dermatán sulfato (DS), condroitín sulfato (CS), queratán sulfato (QS) y ácido hialurónico [1]. En condiciones fisiológicas, los GAGs se encuentran involucrados en diferentes procesos celulares tales como diferenciación, señalización, interacción célula-célula, soporte, anticoagulación y cicatrización, entre otros [2-4]. De igual forma, los GAGs pueden participar en diferentes procesos patológicos como algunos tipos cáncer, infecciones virales y microbianas, inflamación y errores innatos del metabolismo [5-8]. Dentro de este último grupo, las mucopolisacaridosis (MPS) representan un grupo de 12 patologías en las que se encuentra alterado el catabolismo de uno o más GAGs. Dependiendo del GAG acumulado, se pueden presentar alteraciones en hígado, bazo, corazón, ojo, oído, y en los sistemas respiratorios, esqueléticos y nervioso central [9]. Dado que los GAGs son las principales moléculas acumuladas en las MPS, estos se han convertido en importantes biomarcadores mediante su identificación y cuantificación en orina, sangre, líquido cefalorraquídeo o muestras de tejidos. De esta forma, los GAGs son biomarcadores empleados durante las etapas de diagnóstico y seguimiento farmacoterapéutico [5, 10-12], así como también en programas de tamizaje neonatal [13]. La cuantificación de GAGs también representa una herramienta útil durante las diferentes etapas de desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento, siendo uno de los principales biomarcadores empleados para evaluar la eficacia de estos nuevos desarrollos [5]. El análisis de GAGs en muestras biológicas representa un reto importante debido a: 1) su amplia variabilidad estructural, tamaño y sulfatación sumado a una alta densidad de carga, 2) la imposibilidad de amplificar regiones o GAGs específicos, y 3) la amplia variabilidad observada entre tejidos en términos de estructura y concentración [14]. En este sentido, diferentes métodos han sido desarrollados para la identificación o cuantificación de GAGs, incluyendo métodos colorimétricos, cromatografía en capa delgada, electroforesis, ELISA, y espectrometría de masas [1, 5]. Los métodos colorimétricos se basan en la interacción no específica de los GAGs con azul de toluidina, azul alcián o azul de dimetilmetileno [1]. Aunque estos métodos han sido ampliamente utilizados tanto a nivel diagnóstico como de investigación, presentan importantes limitaciones a nivel de especificidad, sensibilidad y facilidad para diferenciar entre los diferentes tipos de MPS, así como a su capacidad para ser empleados en importantes muestras biológicas como lo son sangre o tejidos. Por su parte, las técnicas de cromatografía en capa delgada y de electroforesis permiten la separación parcial de los GAGs, siendo ampliamente empleadas para el análisis de GAGs en orina [15]. Sin embargo, la incompleta resolución de los GAGs, así como su uso limitado en muestras de sangre o tejidos y la baja sensibilidad, limitan el uso de estas técnicas [1]. En el caso del uso de la técnica de ELISA, a pesar de mostrar una alta especificidad y gran sensibilidad, su uso se vio limitado debido a que no es posible realizar la detección simultanea de los distintos GAGs es un mismo pozo [1]. Durante los últimos años, el uso de la espectrometría de masas ha emergido como una de las principales alternativas para resolver muchos de los problemas asociados a la identificación y cuantificación de GAGs en muestras biológicas [1, 5, 14, 16]. Para este fin, los GAGs son depolimerizados en disacáridos mediante métodos enzimáticos (heparinasa, condroitinasa y queratanasa) o químicos (especies reactivas de oxígeno u óxido nitroso), siendo los primeros los que permiten conservar las principales características estructurales de los disacáridos necesarias para realizar su adecuada identificación [14, 16]. Posteriormente, los disacáridos son separados mediante cromatografía líquida o electroforesis capilar, para finalmente ser analizados mediante espectrometría de masas en tándem [14, 16]. Esta estrategia ha sido empleada para la cuantificación de GAGs en muestras de orina o sangre en voluntarios sanos y pacientes con MPS [1, 5, 13, 16]. De manera importante, estos estudios han mostrado la posibilidad de distinguir pacientes con diferentes tipos de MPS, incluso en programas de tamizaje neonatal. Adicionalmente, han mostrado la disminución de su concentración en función de la edad tanto en muestras de sangre como de orina, la elevación secundaria de algunos GAGs en MPS en las cuales el metabolismo directo de algunos de estos compuestos no está alterado, y la importancia de contar con un método con alta sensibilidad y especificidad durante el seguimiento de las terapias aprobabas y en desarrollo [10, 17]. De igual forma, se ha reportado una mayor concentración de GAGs en muestras de plasma y orina de hombres versus los observados en mujeres [18]. Aunque no hay evidencia que indiquen un efecto poblacional sobre los valores de GAGs en muestras de orina o sangre, diferentes reportes muestran que estos valores cambian ampliamente dependiendo de la metodología empleada [17-19]. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha venido empleando métodos colorimétricos y electroforéticos para la identificación y cuantificación de GAGs en orina, los cuales han apoyado el diagnóstico de pacientes con MPS en nuestro país [20, 21], así como la investigación de nuevas alternativas terapéuticas [22-25]. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, estos métodos presentan limitaciones que impiden el análisis de otras muestras de interés en diagnóstico o investigación, así como el desarrollo e implementación de programas de tamizaje neonatal. Este último punto es de gran importancia pues no solo permitiría identificar de forma temprana y asintomática a pacientes MPS, sino que también permitiría, para aquellas enfermedades que cuentan con terapias específicas, un inicio temprano del tratamiento [10, 13]. En Colombia, las MPS son el grupo de enfermedades de depósito lisosomal más estudiadas [21], y cerca de 400 pacientes han sido incluidos en el reporte de enfermedades huérfana-raras del Sivigila entre el año 2016 y el primer periodo epidemiológico del año 2021 [26]. Dado que estos pacientes son identificados en población de alto riesgo (pacientes con sospecha de MPS), no se conoce la frecuencia real de estas enfermedades en nuestro país, lo que podría representar una información valiosa para el diseño de estrategias de intervención en salud pública e investigación. En este sentido, como un primer paso para el establecimiento de un nuevo método de cuantificación de GAGs en nuestro país, el presente proyecto se busca evaluar el uso de un método basado en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la cuantificación de estas moléculas en muestras biológicas o de cultivo celular.
EstadoFinalizado
Fecha de inicio/Fecha fin01/02/2331/12/24

Palabras clave

  • Errores innatos del metabolismo
  • Espectrometría de masas
  • Glicosaminoglicanos
  • Mucopolisacaridosis

Estado del Proyecto

  • Sin definir

Financiación de proyectos

  • Interna
  • Pontificia Universidad Javeriana