Efecto de la regulación de la enzima aromatasa (cyp19a1) sobre la expresión diferencial de proteínas mitocondriales dependiente del sexo, en astrocitos humanos sometidos a estrés metabólico con ácidos grasos

1. Resumen del proyecto: Este proyecto tiene como finalidad identificar el rol de la regulación la enzima aromatasa (CYP19A1) en astrocitos humanos sometidos a un estrés metabólico con ácidos grasos (AG), a partir de la caracterización de la respuesta mitocondrial dependiente del sexo, mediante el análisis diferencial del perfil de expresión proteico. Se han hecho importantes aportes sobre el papel protector de los esteroides en el sistema nervioso, a través del tratamiento farmacológico con compuestos estrogénicos o algunas moléculas similares que modulan esta respuesta. Sin embargo, en muy pocos estudios se tiene en cuenta el dimorfismo sexual, condición que se ha descrito que podría alterar la respuesta a este tipo de tratamientos. Uno de los principales enfoques en la caracterización de la respuesta sexual es el estudio del componente hormonal. El cerebro está expuesto a concentraciones altas de compuestos estrogénicos endógenos, en donde la aromatasa regula la producción y transformación de varios de estos y puede ser empleada en un modelo que contribuya tanto al estudio de las diferencias sexuales, como al entendimiento de los mecanismos protectores mediados por el componente hormonal endógeno en el cerebro. Lo anterior podría resultar de gran interés con el ánimo de proponer mecanismos terapéuticos más efectivos, específicos y selectivos en la prevención o tratamiento de patologías que afecten el sistema nervioso central (SNC). La mayoría de lesiones y patologías que afectan el SNC se caracterizan por la desregulación en alguno de los procesos de sus componentes celulares. Uno de estos son los astrocitos que funcionan como primera línea de defensa ante cualquier cambio en el ambiente cerebral, en donde aparte de cumplir funciones esenciales como la regulación homeostática, el aclaramiento sináptico y el control del flujo sanguíneo cerebral, también desempeñan importantes funciones bioenergéticas, regulando la absorción de glucosa y AG y protectoras brindando apoyo metabólico y antioxidante para las neuronas. Enfermedades como el Alzheimer o Parkinson han descrito como causas de su desarrollo, modificaciones de los procesos astrocitarios y alteraciones que afectan la función mitocondrial, organelo fundamental en el funcionamiento celular, actuando como soporte metabólico ante la alta demanda energética (ATP) que se presenta en el SNC. Los AG son la principal fuente de energía de los astrocitos a través del proceso de β-oxidación. Sin embargo, un aumento en la concentración de AG saturados puede ocasionar la desregulación de procesos mitocondriales, causando entre otras, modificaciones en la expresión de proteínas fundamentales en las dinámicas estructurales y funcionales. Nosotros, presumimos que la actividad estrogénica endógena, regulada por la aromatasa, en los astrocitos humanos puede alterar directa o indirectamente la expresión de proteínas mitocondriales, en situaciones metabólicas adversas favoreciendo la protección celular dependiente del sexo. A pesar de que muchos estudios han abordado los efectos del ácido palmítico en los astrocitos, por ejemplo ¿no se conocen los efectos sobre la expresión de proteínas a nivel mitocondrial?, ¿si existe una expresión diferencial teniendo en cuenta el sexo?, ¿si la actividad estrogénica endógena puede regular la respuesta mitocondrial de los astrocitos expuesto al ácido palmítico (AP)?, o ¿si es posible encontrar nuevos blancos terapéuticos que permitan desarrollar estrategias más específicas y dirigidas para el tratamiento de estas enfermedades ? Para esto, pretendemos desarrollar un modelo experimental basado en el silenciamiento de la aromatasa en astrocitos humanos de hombre y mujer a través de sistema Crispr/Cas9, garantizando la inhibición de la producción estrogénica endógena. Posteriormente, se estimularán con el AG caracterizando parámetros como la viabilidad celular, la activación astrocitaria y la función mitocondrial entre otras. Para el análisis, proteómico se pretende abordar el problema a partir la extracción, cuantificación y expresión de las proteínas mediante técnicas bioquímicas (Western Blot), pero también pretendemos complementar esta investigación con herramientas bioinformáticas que resultan invaluables, ya que 1) simulan con éxito los cambios a nivel sistémico, 2) son ideales para integrar información ómica para mejorar su representación biológica y 3) permiten identificar una cantidad considerable de proteínas que están siendo reguladas en el modelo. Dentro de esto se pretenden encontrar no solo la expresión diferencial de proteínas mitocondriales involucrados en vías y mecanismos protectores, sino también la influencia que puede tener el sexo. Lo anterior, sugiere que, dependiendo del sexo, podrían presentarse diferencias a nivel mitocondrial, que podrían promover un deterioro sobre la integridad celular, generando la aparición de patologías que afectan el SNC. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN Y JUSTIFICACIÓN Las enfermedades neurodegenerativas (EN) se han convertido en un problema mundial de salud pública Holper2018250(1)25025017Holper, LBen-Shachar, DMann, JJMultivariate meta-analyses of mitochondrial complex I and IV in major depressive disorder, bipolar disorder, schizophrenia, Alzheimer disease, and Parkinson diseaseNeuropsychopharmacologyNeuropsychopharmacology120181740-634X(1). La Organización Mundial de la Salud estimó que para el año 2017 unos 6,3 millones de personas padecían alguna de estas y calcula que para 2030 esta cifra ascenderá a los 12 millones Quiñones2018251(2, 3)25125117Quiñones, Natalia Andrea VásquezAporte de las terapias alternativas dentro de los procesos de neurorrehabilitaciónfisioGlía: revista de divulgación en FisioterapiafisioGlía: revista de divulgación en Fisioterapia5-95120182340-6151Silva201825325325317Silva, Thelma Beatriz PavónRodríguez, Grisel BarriosAlzheimer,¡ realidad mundial en incremento!UNIVERSITARIAUNIVERSITARIA26-271320182594-004X(2, 3). La obesidad se ha convertido en un factor de riesgo alto para el desarrollo EN, a partir del incremento en la concentración de AG circundantes que ejercen efectos deletéreos en el SNC (6), Parkinson (9) en modelos animales sometidos a dietas ricas en grasa. Se ha demostrado que los hombres y las mujeres tienen diferentes susceptibilidades a desarrollar algunas enfermedades en el SNC (11). Estos junto a otros factores, como mecanismos epigenéticos, la edad, hábitos de vida pueden inducir efectos adversos sobre las funciones cerebrales y contribuir para el desarrollo de EN (14). En el SNC las proteínas mitocondriales son importantes para el metabolismo de los neurotransmisores y la regulación de la muerte/supervivencia celular a través de la apoptosis Neal2018115(15)11511517Neal, M.Richardson, J. R.Department of Pharmaceutical Sciences, Center for Neurodegenerative Diseases and Aging, Northeast Ohio Medical University, Rootstown, OH 44272.Time to get Personal: A Framework for Personalized Targeting of Oxidative Stress in Neurotoxicity and Neurodegenerative DiseaseCurr Opin ToxicolCurr Opin Toxicol127-13272018/10/032018Feb2468-2934 (Print) 2468-2020 (Linking)30272040https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30272040PMC615726910.1016/j.cotox.2018.02.003(15). Se cree que la oxidación de los AG ocurre casi exclusivamente en los astrocitos a través de sus mitocondrias (17). En pacientes con EP o EA, se han encontrado acúmulos de AP en la neo-corteza parietal y tejidos post-mortem. Muchas investigaciones no tienen en cuenta el papel de los AG como importantes sustratos energéticos para el metabolismo cerebral, sesgando la manera de entender cómo funcionan y confirmando la importancia de estudiar el comportamiento de los astrocitos, que cada vez se sabe que son mucho más complejos e importantes y que juegan un papel fundamental en el mantenimiento del correcto funcionamiento del SNC (20). Estudios in vivo e in vitro han evaluado la respuesta a este AG saturado en astrocitos, en donde indujo inflamación hipotalámica en ratones machos, pero no en hembras, los machos mostraron niveles aumentados de citoquinas como también un aumento de los niveles de ceramidas y glucosilceramidas Ventura-Clapier2017118(21)11811817Ventura-Clapier, RenéeMoulin, MarylinePiquereau, JérômeLemaire, ChristopheMericskay, MathiasVeksler, VladimirGarnier, AnneMitochondria: a central target for sex differences in pathologiesClinical scienceClinical science803-822131920170143-5221(21). Las investigaciones con animales e in vitro muy pocas veces incluyen al sexo femenino para la evaluación de lesiones y/o respuestas a tratamientos, teniendo en cuenta que cada vez es más evidente las diferencias dependientes del sexo (26). Las probabilidades de presentar estas depende de varios factores, incluyendo el hormonal, la genética, las influencias ambientales, el tipo de dieta y la actividad física, así como la distribución de tejido adiposo. Para abordar este problema, esta propuesta tiene como pregunta de investigación: ¿El daño mitocondrial inducido por AP en el astrocito humano y los mecanismos protectores de la actividad estrogénica son dependientes del sexo? Esta pregunta se basa en la hipótesis de que los hombres y las mujeres difieren en su respuesta a las señales metabólicas y en su propensión a desarrollar patologías del SNC. Por otra parte, este proyecto pretende abordar esta problemática con nuevas tecnologías de alto rendimiento que permitan el análisis simultáneo de biomoléculas a varios niveles celulares. En ese aspecto, se pretende realizar una aproximación que permite el análisis proteómico de la composición mitocondrial desde una perspectiva de la biología de sistemas, convirtiéndose en una herramienta complementaria, buscando determinar perfiles proteicos mitocondriales diferenciales de astrocitos humanos a partir de un modelo metabólico astrocitario, que apoye los resultados experimentales encontrados. Esperamos que los resultados sean de gran impacto para la comunidad científica nacional e internacional, con el objetivo de determinar las diferencias sexuales en la actividad mitocondrial que pueden servir para el desarrollo de posibles terapias más específicas.