Edición génica mediante el uso del sistema CRISPR/nCas9 y un método de entrega no viral para la enfermedad de Tay-Sachs

Las gangliosidosis GM2 son un grupo de errores innatos del metabolismo causados por mutaciones en tres proteínas responsables del catabolismo del gangliósido GM2 y otros esfingolípidos. Las deficiencias en las enzimas Hexosaminidasas (Hex) A y B, o el cofactor GM2A están asociadas con las enfermedades de Tay-Sachs (TS), Sandhoff, o la variante AB, respectivamente, las cuales se caracterizan principalmente por ser enfermedades neurodegenerativas y para las cuales en la actualidad no se cuenta con una terapia aprobada [1]. Entre las diferentes alternativas de tratamiento, la terapia génica se presenta como una de las principales opciones, la cual se ha evaluado en diferentes modelos animales pequeños y grandes [1, 2], y para la cual recientemente se reportaron los primeros resultados de su evaluación clínica [3]. Sin embargo, debido a que en la mayoría de estos estudios se han utilizado vectores virales (AAV o lentivirales) [1, 2], los riesgos asociados al uso de estos vectores, como lo son la posibilidad de mutaciones insercionales o la aparición de hepatocarcinomas, así como la preexistencia o la generación de anticuerpos contra los vectores, limitan la aplicabilidad de esta estrategia de tratamiento. Por esto, la edición del genoma mediante el uso del sistema CRISPR/Cas9 en conjunto con vectores no virales se ha convertido en una estrategia novedosa para superar las limitaciones de vectores virales en las gangliosidosis GM2 [4, 5] y otras enfermedades de depósito lisosomal (EDL) [6-8]. Los gangliósidos son glicolípidos complejos conformados por una ceramida unida a un azúcar y con por lo menos una molécula de ácido siálico [9]. Estás moléculas se encuentran presentes en la membrana celular en dominios ricos en caveolina y participan en funciones celulares importantes tales como organización de la membrana, diferenciación neuronal, adhesión celular, transducción de señales, inflamación y crecimiento de neuritas [9]. Para el caso de las gangliosidosis GM2, como consecuencia de las mutaciones en las proteínas HexA, HexB o GM2A, el gangliósido GM2 y otros esfingolípidos se acumula al interior del lisosoma [2, 10]. Esta acumulación tiene consecuencias importantes en la homeostasis celular afectando la degradación de otras macromoléculas y de organelos y la maduración neuronal, e induciendo muerte neuronal, neuroinflamación y estrés oxidativo [1, 9]. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha venido trabajando en el estudio de estas enfermedades y la evaluación herramientas biotecnológicas para diferentes EDL, incluyendo el uso de proteínas recombinantes, terapia génica y el uso de moléculas pequeñas [11, 12]. Dentro de estas herramientas, en los últimos 4 años hemos trabajado en el desarrollo de una estrategia de edición génica basada en el uso de CRISPR/Cas9 y vectores no virales para el tratamiento de la Mucopolisacaridosis IV A [13, 14], mucopolisacaridosis IIIB [15, 16] y gangliosidosis GM2 [17]. Para el caso de las enfermedades de TS y Sandhoff, la evaluación en fibroblastos de pacientes mostró un aumento significativo de la actividad HexA y HexB, la reducción de la masa lisosomal y de biomarcadores de estrés oxidativo [17]. Adicionalmente, la evaluación in-vitro mostró que esta estrategia no presenta alteraciones detectables en regiones no deseadas del genoma (off-targets), demostrando la seguridad de esta aproximación [13]. A la fecha este sistema ha sido evaluado en fibroblastos de pacientes con enfermedad de TS y Sandhoff, pero se desconoce su efecto sobre células del sistema nervioso central (SNC) o sobre un modelo animal de estas enfermedades. En este sentido, este proyecto evaluará la estrategia de edición del genoma no viral basada en CRISPR/nCas9 para TS, mediante la realización de ensayos in-vitro empleando diferentes líneas celulares del SNC (neuroglía), así como la evaluación in-vivo mediante el uso del modelo de murino de TS (HexA-/-Neu3-/-), recientemente desarrollado por el grupo de investigación del Dr. Seyrantepe (Izmir Institute of Technology, Turquia) el cual replica la presentación infantil clásica de esta enfermedad [18]. Este modelo de ratón de la enfermedad de TS, presenta movimientos lentos, ataxia, temblores, deterioro de la coordinación motora y déficit de memoria; así como también acumulación masiva de gangliósidos GM2, GM3, LacCer y GA2, y varias alteraciones celulares y bioquímicas [18]. Además, la neuroinflamación se ha postulado como un mecanismo fisiopatológico debido a la activación excesiva de células gliales y la infiltración de numerosas células inflamatorias [19]. Durante el último año hemos venido trabajando en la construcción de un proyecto colaborativo con el grupo de investigación del Dr. Seyrantepe, con el objetivo de continuar estudiando las bases celulares y moleculares de la enfermedad y desarrollar alternativas de tratamiento. En el marco de esta colaboración, fuimos favorecidos por una convocatoria de movilidad financiada por MinCiencias y TUBITAK (Turquía), la cual permitirá la movilidad de estudiantes e investigadores de los dos laboratorios (Convocatoria 899 del 2022, PPTA 9630). Hasta el momento hemos recibido la visita de un estudiante de doctorado de Turquía y unos de nuestros estudiantes realizará la visita a mediados del mes de octubre del 2022. De ser aprobado, el laboratorio del Dr. Seyrantepe apoyará nuestro proyecto durante la realización de los experimentos en animales, mediante la visita de el estudiante de doctorado adscrito al presente proyecto en el marco del proyecto de movilidad, así como los experimentos in vitro facilitando algunas de las celulas que se emplearían en el proyecto. En resumen, este proyecto busca continuar avanzando en el estudio de CRISPR/Cas9 como alternativa de tratamiento para la enfermedad de TS, así como el entendimiento de las bases celulares y moleculares de la enfermedad, que podría aportar al estudio de nuevas intervenciones para otros errores innatos del metabolismo y enfermedades neurodegenerativas. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN. A la fecha existen numerosos estudios que proponen estrategias de tratamiento para la enfermedad de Tay-Sachs basadas en terapia génica, proteínas recombinantes, o chaperonas farmacológicas [1, 2, 20]. Sin embargo, ninguno de ellos ha sido aprobado, por lo que aún existe una necesidad médica insatisfecha para esta enfermedad. La edición génica mediante la herramienta CRISPR/Cas9 es una aproximación novedosa en el diseño de estrategias de terapia génica para enfermedades de depósito lisosomal como la enfermedad de TS [13, 21,5]. Sin embargo, los resultados de los estudios en el uso de CRISPR/Cas9 para la enfermedad de TS han mostrado un alto riesgo de cortes en regiones no deseadas del genoma (off-target), por lo que se ha visto la necesidad de evaluar alternativas mejoradas de CRISPR/Cas9, como lo es el uso de la enzima Cas9 nicasa (nCas9). Nuestro grupo de investigación ha avanzado en el diseño y evaluación del sistema CRISPR/nCas9 empleado fibroblastos de pacientes con mucopolisacaridosis IVA y las enfermedades TS y Sandhoff [13, 14, 17]. Los resultados han mostrado el potencial de esta herramienta para corregir el defecto enzimático y algunas de las alteraciones celulares. Sin embargo, aún se desconoce el impacto de esta estrategia de edición génica sobre biomarcadores de la enfermedad en modelos celulares relevantes para la enfermedad, como lo son células del sistema nervioso central (p.ej. neuroglía), así como también sobre el modelo animal TS recientemente desarrollado. La realización de estos experimentos permitirá generar información valiosa para el diseño de futuros ensayos pre-clínicos y clínicos, así como continuar comprendiendo las bases moleculares y celulares de la enfermedad de Tay-Sachs. De igual forma, este proyecto aportará a la formación de un estudiante del doctorado en Ciencias Biológicas y a consolidar la colaboración con el laboratorio del Dr. Seyrantepe (Instituto de Tecnología de Esmirna, Turquia). Finalmente, es importante mencionar que el desarrollo de este proyecto permitirá seguir construyendo las capacidades tecnico-científicas para el desarrollo de terapias avanzadas en nuestro país, que puedan posteriormente ser empleadas para el desarrollo de terapias para otras enfermedades raras o de interés nacional.