Dinámica de los grupos funcionales microbianos presentes en los biorreactores pasivos durante la remediación de drenajes ácidos de mina (DAM) del distrito minero de Zipaquira.- Propuesta colaborativa U. Central y PUJ

Aunque los reactores pasivos son una opción efectiva para la remediación de los DAM y los efectos de los parámetros de diseño sobre la eficiencia de los reactores han sido descritos1-3 la relación entre los parámetros de operación y la comunidad microbiana durante el funcionamiento de los biorreactores no ha sido completamente estudiada. Este tipo de estudios son esenciales para asegurar el funcionamiento de los biorreactores y ayudar a mejorar su diseño y rendimiento a largo plazo4. Hasta ahora la mayoría de investigaciones se han enfocado en correlacionar la eficiencia de los biorreactores con el conteo de BSR a través de la técnica del número más probable (NMP). Esta técnica es probabilística y está limitada por la capacidad de los microorganismos para crecer en el medio de cultivo. Además solo una pequeña cantidad (1%) de los microorganismos son cultivables5. Las técnicas de cultivo limitan el conocimiento de las comunidades microbianas, mientras que técnicas moleculares modernas permiten cuantificar y entender la dinámica de las comunidades en diferentes ambientes. Por lo tanto, cuantificar la abundancia absoluta de los genes funcionales permitirá determinar la dinámica y evolución de la comunidad microbiana que fue caracterizada en una investigación previa (Illumina). Además, se podrá determinar si existe correlación entre los grupos funcionales y los parámetros de operación en los biorreactores pasivos Marco teórico Durante la explotación del carbón se producen drenajes ácidos de mina (DAM), considerados como el principal contaminante en las áreas mineras a nivel mundial6. Estos drenajes se caracterizan por un bajo pH, alta concentración de sulfatos y metales disueltos. Los biorreactores pasivos son una tecnología sostenible para remediar el DAM con un bajo costo de mantenimiento, facilidad de operación en áreas remotas y aprovechamiento de desechos agroindustriales de la región7. Los biorreactores pasivos son columnas empacadas con una mezcla reactiva conformada por sustratos orgánicos y celulósicos como fuentes de carbono y energía, un componente inorgánico (piedra caliza, arena, gravilla) como material de soporte y un inóculo microbiano. Durante el funcionamiento, el DAM pasa a través de la mezcla reactiva bajo un TRH, con el fin de incrementar la alcalinidad y el pH, reduciendo los sulfatos y generando sulfuro que reacciona con los metales disueltos para forman minerales insolubles y así poderlos remover8. Diferentes estudios indican que el rendimiento y longevidad de los biorreactores depende de la actividad de las bacterias sulfato-reductoras (BSR)9-11,debido a que éstas reducen el sulfato a sulfuro cuando tiene una fuente de carbono disponible y los sulfuros reaccionan con los metales para formar un precipitado de sulfuro metálico12. Sin embargo, las BSR no pueden oxidar directamente fuentes complejas de carbono y dependen del metabolismo de otras bacterias como las fermentadoras y celulolíticas presentes en el reactor9.Esto implica que el número de bacterias degradadoras de fuentes complejas de carbono es otro factor crítico que afecta el rendimiento de los reactores a largo plazo11. Los métodos tradicionales de cultivo no se consideran eficaces para cuantificar grupos microbianos, debido a que requieren mucho tiempo y subestiman el número de bacterias. Los métodos moleculares sin embargo, pueden proveen información precisa sobre el número y posible función, mediante la amplificación de genes funcionales. La detección de las BSR se ha llevado a cabo mediante el uso de gen dsrA que codifica para la subunidad ¿ de la enzima desasimilativa sulfato reductasa encargada de catalizar la reducción del (bi) sulfito a sulfuro13. Este gen ha sido ampliamente utilizado como marcador molecular durante la detección y enumeración de BSR en diferentes ambientes con gran eficiencia debido a que está evolutivamente conservado y es un gen constitutivo14,15. Para el caso de las bacterias celulolíticas, la hidrólisis de celulosa es catalizada por enzimas pertenecientes al grupo de las glucosidasas, las cuales están dividas según su estructura y función en familias de enzimas16. La mayoría de las glucosidasas de microorganismos anaerobios pertenecen solo a tres familias: 5, 9 y 4810. La familia 48 incluye en su mayoría exonucleasas, codificadas por el gen cel48, de única copia en los genomas de los microorganismos celulolíticos17. En casi todas las bacterias fermentativas (microorganismos anaerobios estrictos o facultativos), los electrones reducidos se canalizan a H2 través de hidrogenasas18. Estas metaloenzimas pueden ser clasificadas en 3 grupos basadas en el número e identidad de sus sitios activos: [NiFe-, [FeFe- y [Fe-hidrogenasas19. El gen hydA codifica para una proteína de 350 aminoácidos que corresponde a la subunidad alfa de la hierro hidrogenasa20,21. La cuantificación de los grupos funcionales microbianos mediante la amplificación de los genes dsrA, cel48 y hydA por qPCR ha permitido el estudio de su dinámica bajo la influencia de diferentes factores que determinan la eficiencia de los reactores sulfato reductores. En previos estudios se ha demostrado como la aclimatación a condiciones sulfato reductoras22, la composición de los sustratos orgánicos10,23,24, el efecto de la bioaumentación y bioestimulación25 y las condiciones medio ambientales y de operación de los biorreactores pueden afectar a las comunidades microbianas, y por lo tanto el éxito para la remoción de sulfatos y metales. La sulfato reducción, degradación de celulosa y la fermentación son procesos que co-existen en los reactores para la remediación de DAM. Comparado con estudios basados en la amplificación y secuenciación del 16s rRNA(como el ilumina), el estudio de los genes que codifican enzimas responsables de funciones filogenéticamente diferentes es ventajoso porque da información funcional directa10. La mayoría de estudios y seguimiento por qPCR de diversos grupos funcionales microbianos se ha realizado principalmente en los inóculos empleados para los biorreactores. En investigaciones previas22, se demostró que inóculos aclimatados a condiciones sulfato reductoras eran más eficientes. Posteriormente, se compararó la composición y actividad de cinco inóculos, reportando la relación entre la composición microbiana y su capacidad de remediación del DAM26. Los resultados mostraron que inóculos que contenían bacterias sulfatos reductoras, fermentadoras y degradadoras de polisacáridos permitían un mayor rendimiento de los reactores en relación con la remoción de sulfatos y a la neutralización del pH. También se ha demostrado como diferentes sustratos orgánicos dentro del biorreactor pueden afectar el número y composición de BSR23. De forma similar, se han evaluado el efecto de sustratos simples y complejos sobre la composición y número de BSR, y aunque el mayor número se encontró en el sustrato simple (etanol), las comunidades más diversas fueron encontradas en los sustratos complejos (lignocelulósicos)24. En estudios previos, se diseñaron, validaron y adaptaron primers para llevar a cabo la cuantificación de grupos funcionales mediante qPCR, en dos tipos de biorreactores: uno empacado con material lignocelulósico y el otro alimentado con etanol10. La amplificación por qPCR de estos genes mostró gran número de microorganismos degradadores de celulosa y fermentadores en el reactor formado por material lignocelulósico, mientras que en el reactor alimentado con etanol dominaban las BSR10. También se determinó el efecto de la bioaumentación con BSR o celuloliticas y bioestimulación con etanol o carboximetil celulosa en columnas que simulaban barreras reactivas sulfato reductoras25. La cuantificación de los genes funcionales dsrA, cel48 y hydA permitió identificar que tanto la bioestimulación como la bioaumentación tienen impacto en la comunidad que se establece durante el estado estacionario, lo que sugiere que existe la posibilidad mejorar la composición de la comunidad microbiana25. En Colombia se han realizado pocos estudios para el tratamiento de DAM. Una primera aproximación fue el estudio de la biosorcio¿n de Fe, Al y Mn de drenajes ácidos de minas de carbón empleando algas marinas Sargassum sp.27. Se ha realizado también la remoción de metales pesados de DAM de carbón usando tres diferentes especies BSR (Desulfovibrio desulfuricans, Desulfomonas pigra y Desulfobacter spp)28. Los microorganismos se aplicaron a disoluciones que simulaban las composiciones químicas de los drenajes de minas de carbón en Colombia, y los resultados mostraron un alto porcentaje de remoción de hierro, níquel, cinc, cobalto y baja remoción para el manganeso28. Por ultimo, la aplicación del Modelo de Bohart y Adams en la remoción de mercurio de DAM por adsorción con carbón activado29. Desde el 2013 se ha desarrollado el proyecto ¿Evaluación de biorreactores pasivos para la remediación del DAM del distrito minero de Zipaquira¿ y se han logrado resultados promisorios para el escalamiento en campo de los reactores pasivos30,31. Sin embargo, los estudios sobre la comunidad bacteriana están aun incompletos. Hasta el momento se ha caracterizado la comunidad secuenciando la region V4 del 16s rRNA por illumina, pero aun está pendiente la cuantificación de los principales grupos funcionales involucrados en la remediación del DAM (BSR, celulolíticas y fermentadoras). A partir de esta investigación se quiere esclarecer como la dinamica, evolución y las interacciones entre estos grupos funcionales puede ayudar a mejorar la eficiencia de los tratamientos en el futuro, lo cual permitirá datos más concisos y completos para el escalamiento de los reactores pasivos a escala piloto en campo.