Determinación de lactosuero en la leche cruda, a partir de la cuantificación del glicomacropeptido de caseína por HPLC.

1.1. Planteamiento del problema de investigación y Justificación: Actualmente, un problema en la industria láctea es la adulteración de la leche con lactosuero alterando las propiedades fisicoquímicas de esta [1. Estas modificaciones no son detectadas con las técnicas analíticas básicas utilizadas en esta industria láctea como son pruebas de pH, crioscopia, entre otras. Esta práctica genera una disminución en la calidad del alimento y a nivel industrial en su procesamiento debido a que el lactosuero contiene la enzima quimosina [2 que modifica las propiedades de la leche, generando alteraciones en el producto final y además, debido a su manipulación puede conducir a un deterioro en su calidad microbiológica. Se estima también que la alteración del contenido proteico de la leche puede disminuir su estabilidad y presentar problemas durante su paso a través de los equipos de esterilización. Esta problemática afecta directamente a consumidores, proveedores y distribuidores, y trae consecuencias de índole nutricional, económica y legal [3, 4. Por lo anterior, surge la necesidad de contar con una técnica confiable que permita detectar la adición de lactosuero en la leche cruda. Por medio de la cromatografía liquida de alta eficacia (HPLC), se ha logrado la cuantificación del glicomacropéptido de caseína (casein-glycomacropéptide) GMP, que es un péptido que se origina cuando al adicionar el lactosuero (que contiene quimosina) a la leche cruda, la proteína caseína se rompe en el enlace de los aminoácidos 105-106 dando origen a una molécula solubles, que comprende la región entre los residuos 106 a 169 C-terminal de la proteína [5, 6. El sub-sector lácteo es un mercado que se caracterizada por su excelente calidad y la constante innovación tecnológica en producción, creación y mejoramiento continuo, el cual se ha preocupado por obtener una leche con estándares de calidad internacionales desde el mismo momento de la recolección, hasta su llegada al punto de venta [3. Un problema que se genera en la línea de calidad es establecer el estado de la leche cruda con el fin de determinar su pureza y evidenciar la adulteración de esta [1. En algunos casos los proveedores que surten esta materia prima a las industrias lácteas aplican esta adulteración dificultando su detección con la neutralización del pH y enmascarándose en los análisis fisicoquímicos habituales que se le realizan a la leche cruda una vez llega a la planta de acopio antes de entrar al proceso de pasteurización, por lo que la industria láctea necesita contar con una técnica para la detección de la adulteración con lactosuero en la leche cruda, debido a que en el país no se cuenta con las normas técnicas ni un protocolo de dicha técnica, por lo que su implementación se convierte en una herramienta valiosa para la industria láctea. La compañía Productos Naturales de la Sabana S.A., una de las empresas mejor posicionadas en esta industria y la Pontifica Universidad Javeriana quieren ser pioneros en el desarrollo de la misma para poder llevar a cabo estos análisis siempre buscando una mejor calidad en la leche cruda y por ende en los producto que se le ofrece al consumidor final. Teniendo en cuenta la problemática mencionada se plantea implementar o establecer la técnica HPLC para la determinación de lactosuero en la leche cruda a través de la cuantificación del glicomacropéptido de caseína que es el indicador de la adulteración, en la Pontificia Universidad Javeriana. Este trabajo es netamente de investigación, como una herramienta para mejorar y garantizar una mejor calidad de este producto. Adicionalmente, tiene una proyección de prestación de servicios a futuro teniendo en cuenta los resultados que se logren en el proyecto. 1.2 Marco Teórico y Estado del Arte: La leche se entiende como el producto integral del ordeño total, en condiciones de higiene que da la vaca lechera en un buen estado de salud y alimentación, sin aditivos de ninguna especie. La fracción proteica de la leche contiene un gran número de compuestos biológicamente activos. Además de las proteínas de la leche (caseínas, albumina y globulinas), existen también pequeñas cantidades de otras proteínas y péptidos. Estos péptidos, que son inactivos dentro de la secuencia de la proteína nativa, pueden ser liberados por hidrólisis enzimática, por ejemplo, durante la digestión gastrointestinal o durante el procesado del alimento. Estos péptidos bioactivos procedentes de proteínas lácteas presentan una actividad moduladora de numerosos procesos metabólicos del organismo (catabolismo y anabolismo). Asimismo, las proteínas del suero lácteo representan una mezcla variada de proteínas secretadas, tales como alfa-lactoalbúmina, alfa-lactoglobulina, lactoferrina, lactoperoxidasa, inmunoglobulinas, quimosina, glicomacropéptido y una gran cantidad de factores de crecimiento. Estas tienen una serie de efectos biológicos, que van desde un efecto anticancerígeno hasta efectos en la función digestiva [7. La caseína hace parte de un grupo de proteínas secretadas en la leche de la mayoría de los mamíferos, es una fosfoproteina producida por cuatro genes que codifican para las caseínas ¿s1, ¿s2, ß y ¿, las cuales se organizan en forma de micelas o unidades solubles. La k-caseína tiene un alto contenido de aminoácidos esenciales que se separan de la parte acuosa por acción de enzimas como la quimosina, dos fracciones se originan el fragmento para-k caseína, el cual precipita en la elaboración de quesos debido a su hidrofobicidad y el fragmento correspondiente al glicomacropéptido que es soluble. Dentro de las caseínas de la leche, la k-caseína tiene gran influencia en la composición de la leche en relación con su capacidad de coagulación, tasa de formación de la cuajada y vigor del coagulo en la producción de queso para consumo humano. El conocimiento de los factores que definen el nivel de k-caseína en la leche es de relevancia para los productores y procesadores, puesto que la elevación de su contenido puede derivar en un mayor rendimiento del producto para la elaboración de derivados lácteos y, a su vez, en un mayor beneficio económico [8. El lactosuero de quesería es un subproducto líquido obtenido después de la precipitación de la caseína durante la elaboración del queso. Contiene principalmente lactosa (4,5 % p/v), proteínas (0,8% p/v), sustancias de importante valor nutritivo, minerales, vitaminas y grasas. Lo que hace que tenga características similares a las de la leche cruda y por esta razón es utilizado como un adulterante ya que esto dificulta su detección. La composición y tipo de lactosuero varía considerablemente dependiendo del tipo de leche, tipo de queso elaborado y la tecnología empleada para la precipitación de la caseína; si en la coagulación de la leche se utilizan enzimas (quimosina, renina) el lactosuero se denomina dulce, que está basado en la coagulación por la acción de la renina a pH 6,5, y si se emplean ácidos orgánicos (ácido cítrico, fórmico, acético, málico) se denomina lactosuero ácido, resulta del proceso de fermentación o adición de ácidos orgánicos o ácidos minerales (ácido sulfúrico, ácido clorhídrico) para coagular la caseína en la elaboración de quesos frescos [9. El lactosuero cuenta con una serie de factores que favorecieron su valorización, logrando que se utilice como materia prima de productos de alto valor nutritivo y no sea únicamente un desecho industrial altamente contaminante. Como puede ser la aplicación de los concentrados de proteína de suero en productos bajos en grasa, empleo de derivados proteicos de suero en postres y productos de confitería, tecnologías de membrana y obtención de aislados de suero (WPI) entre otros [10. El Glicomacropéptido (GMP) es un glicopéptido C-terminal que se escinde de la molécula de k- caseína por la acción de la quimosina durante la precipitación de las caseínas en el proceso de elaboración del queso. El glicomacropéptido es hidrofílico y se mantiene en suspensión en la fracción del suero mientras que la sección restante (para kappa-caseina) de la k-caseína precipita para formar parte del cuajo. El GMP tiene un peso molecular de 8.000 Dalton, es un glicopéptido que forma agregados a pH neutro y contiene un 50-60% de carbohidratos en su composición (galactosa, N-acetil-galactosamina y ácido N- neuramínico). Es rico en aminoácidos de cadena ramificada (ácido glutámico, lisina y alanina) [2 deficiente en metionina y no contiene fenilalanina. El GMP ha mostrado capacidad de neutralizar toxinas microbianas, inhibir la adhesión de bacterias cariogénicas o de virus de la gripe. Regula el sistema inmune y promueve el crecimiento de las bifidobacterias (un grupo de bacterias que normalmente viven en los intestinos) [11. Además, regula la circulación sanguínea y tiene acción antihipertensiva y antitrombótica. GMP presenta propiedades sobre el sistema digestivo, reduce las secreciones gástricas y la movilidad estomacal. Además, estimula la liberación de colecistoquinina, hormona relacionada con la saciedad. El glicomacropéptido contiene ácido siálico que le confiere beneficios sobre el desarrollo cerebral y potencia el aprendizaje [2. Un adulterante es una sustancia que puede ser añadida intencionalmente a los productos para aumentar las cantidades visibles y reducir los costes de fabricación [12. Algunos alimentos suelen ser adulterados con el fin de obtener un beneficio económico mayor. Los alimentos de la industria láctea en Colombia se encuentran regulados por el decreto 616 de 2006, en el cual se expidió el reglamento técnico que señala los requisitos que debe cumplir la leche para el consumo humano que se obtenga, procese, envase, transporte, comercialice, expenda, importe o exporte en el país. Mencionamos algunos de los parámetros del decreto que influirán en la realización del proyecto: Artículo 6°. Características físico químicas de la leche cruda para consumo humano directo. La leche cruda para consumo humano