Descripción del perfil epigenético en fibroblastos de pacientes con Mucopolisacaridosis IIIB y IVA.

RESUMEN EJECUTIVO Las mucopolisacaridosis (MPS) son errores innatos del metabolismo (EIM), del grupo de las enfermedades de depósito lisosomal (EDL), de carácter hereditario y caracterizadas por mutaciones monogénicas que afectan la actividad de enzimas que contribuyen a la degradación de glucosaminoglicanos (GAGs) al interior del lisosoma. En el caso particular de la MPS IIIB y la MPS IVA, mutaciones en los genes que codifican para las enzimas Alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU) o N-acetilgalactosamina-6-Sulfatasa (GALNS), respectivamente, provocan la pérdida o disminución de la actividad catalítica de dichas enzimas y por tanto provocan la acumulación lisosomal de GAGs. La acumulación de heparán sulfato en pacientes con la MPS IIIB conlleva principalmente al deterioro del sistema nervioso central, capacidad de adaptación y la muerte precoz. Por su parte, la acumulación de queratán sulfato y condroitín 6-sulfato provoca la aparición de alteraciones motoras, displasia esquelética, hiperflexibilidad articular, opacidad corneal y complicaciones cardiacas en pacientes con MPS IVA. Aunque la MPS IIIB y la MPS IVA son patologías de baja prevalencia (menos de 1 por cada 5.000 personas, Ley 1392 de 2010/Ley 1438 de 2011, para las cuales, 18 y 180 pacientes, respectivamente, fueron diagnosticados entre 2016 y 2019 de acuerdo al SIVIGILA), los individuos que la padecen, así como sus familiares enfrentan una disminución severa en su calidad de vida. A pesar de la importante morbi-mortalidad que podrían suponer estas patologías, en la actualidad no existe una terapia eficiente que permita corregir los defectos enzimáticos que provocan la acumulación subcelular de intermediarios metabólicos. La búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas para estas enfermedades incluye el uso de proteínas recombinantes (terapia de reemplazo enzimático), trasplante de células madre hematopoyéticas, terapia de reducción de sustrato, chaperonas farmacológicas y terapia génica. Cada una de estas alternativas ha mostrado diferentes grados de eficacia en modelos celulares y animales, así como en ensayos clínicos, por lo que aún es necesario el desarrollo de investigaciones que permitan mejorar las terapias actuales o el desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento como edición de genes con el sistema CRISPR-Cas9. Adicionalmente, un punto importante desde el punto de vista del diagnóstico, tratamiento y progreso de la enfermedad en errores innatos del metabolismo (EIM), es la heterogeneidad en los fenotipos de pacientes con defectos monogénicos idénticos o similares, lo que sugiere que la mutación puntual puede no ser el único determinante en el desarrollo de la enfermedad. En este sentido, cambios epigenéticos parecen jugar un rol importante en el desarrollo de este tipo de enfermedades, así como en la respuesta al tratamiento. Por ejemplo, para algunos EIM se han identificado cambios en la metilación del ADN y en los niveles de acetilación de histonas con respecto a células de individuos no afectados. Adicionalmente, el tratamiento con inhibidores de histonas desacetilasas han mostrado un efecto en la reducción de acúmulos lisosomales, sugiriendo una asociación entre el defecto metabólico, la acumulación de sustratos y los cambios en el perfil epigenético. Sin embargo, este es un campo de investigación que solo recientemente ha ganado atención para las EDL y para el cual muy pocos estudios se han desarrollado. Para el caso específico de las MPS IIIB y IVA, dos de las enfermedades actualmente bajo investigación en el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo, hasta el momento se desconoce si existe una relación entre la deficiencia enzimática y los cambios en el perfil epigenético de las células. En este contexto, este proyecto plantea caracterizar el perfil epigenético asociado a las MPS IIIB y IVA al describir el nivel y distribución espacial de marcas epigenéticas asociadas a la represión (metilación del DNA -meCpG- y trimetilación de la histona H3 en su lisina 9 - H3K9me3) o inducción de la expresión génica (acetilación de la histona H3 en su lisina 14 - H3K14ac). Para este fin se comparará el perfil epigenético observado en fibroblastos de pacientes con MPS IIIB y IVA respecto al observado en fibroblastos de individuos no afectados por la enfermedad. Además, se evaluará la asociación entre características epigenéticas distintivas de la enfermedad con la expresión de los genes codificantes para las enzimas NAGLU y GALNS, así como el efecto del tratamiento mediante terapia de reemplazo enzimático o con un inhibidor de las desacetilasas de histonas. Los resultados de esta investigación permitirán generar conocimiento acerca de la posible participación de mecanismos epigenéticos en el desarrollo de las MPS, así como información relevante para el desarrollo de posibles intervenciones para el tratamiento de MPS y de otros errores innatos del metabolismo. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Las mucopolisacaridosis IIIB y IVA son EIM producidos por mutaciones en los genes que codifican para las enzimas NAGLU (E.C. 3.2.1.50) y GALNS (EC 3.1.6.4), respectivamente. Se ha encontrado que al menos 118 mutaciones en el gen NAGLU causan MPS IIIB, mientras que para MPS IVA se han encontrado al menos 148 de mutaciones en el gen GALNS que producen la enfermedad. En la MPS IIIB, la deficiencia total o parcial de la actividad de la hidrolasa lisosomal NAGLU interrumpe la descomposición del GAG ​​heparán sulfato, siendo su acumulación lisosomal el principal responsable del cuadro clínico [1]. Otras características del cuadro clínico surgen como resultado del almacenamiento secundario de glucosfingolípidos y de procesos como estrés oxidativo y neuroinflamación [2]. La alteración de estos procesos celulares, que ocurre principalmente en el sistema nervioso central (SNC), conducen a deficiencia cognitiva grave, regresión del desarrollo y otras manifestaciones neurológicas como el trastorno del espectro autista y trastornos del sueño [3]. Por su parte, en la MPS IVA, la deficiencia de la enzima GALNS conduce a la acumulación de condroitin-6-sulfato y queratán sulfato, principalmente en el cartílago y en su matriz extracelular, lo que lleva a alteraciones en el desarrollo óseo, displasia esquelética sistémica, alteraciones en la actividad locomotora, opacidad corneal, disfunción cardiaca y reducción en la expectativa de vida de las personas que padecen el trastorno [4]. Algunos estudios han reportado que la metilación del ADN y la acetilación de histonas parece jugar un papel importante en el desarrollo de algunos EIM. Con respecto a la metilación del ADN, se ha observado que en células de pacientes con síndrome de Hunter se presentan un incremento en la metilación de la región entre el exón 2 y el intrón 3 del gen iduronato-2-sulfatasa [5]. Por su parte, en pacientes con MPS IVA el 21.9% muestra mutaciones en regiones del ADN susceptibles a metilación [6]. De forma interesante, se reportó que en un modelo murino de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC), células del cerebelo muestran un incremento en la metilación del ADN en regiones promotoras específicas, así como una disminución en la expresión de algunas ADN metiltransferasas [7]. Con respecto a la acetilación de histonas, se ha reportado que células de sangre periférica de pacientes con la enfermedad de Gaucher presentan niveles más bajos de acetilación de histona H4 en comparación con lo observado en personas no afectadas por la enfermedad [8]. De forma interesante, el uso de inhibidores de las desacetilasas de histonas (HDACi), tales como el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) o LBH-589 (panobinostat) permitieron rescatar la función de la enzima deficiente fibroblastos de pacientes con la enfermedad de Gaucher [9, 10]. De igual forma, en fibroblastos de pacientes con la enfermedad de NPC, donde se observa alteraciones en la expresión de HDACs, el tratamiento con SAHA permitió revertir dicha alteración, aumentar la actividad de la enzima deficiente y la normalización de almacenamiento de colesterol característico de esta enfermedad [11-13]. En resumen, estos estudios muestran el rol potencial de la regulación epigenética en las EDL. Sin embargo, a la fecha se desconoce si la deficiencia enzimática presente en las MPS IIIB y IVA, y la subsecuente acumulación lisosomal de GAGs, se encuentra asociada con cambios en los perfiles epigenéticos y la expresión génica en células de pacientes afectados con estas enfermedades, o si el tratamiento de reemplazo enzimático o la inhibición de la desacetilación de las histonas puedan revertir tales cambios. En este sentido, el presente proyecto busca evaluar el efecto farmacológico de la terapia de reemplazo enzimático y la inhibición de las deacetilasas de histonas sobre marcadores epigenéticos asociados a represión o inducción de la expresión génica en fibroblastos de pacientes MPS IIIB y MPS IVA. JUSTIFICACIÓN Las MPS IIIB y IVA son enfermedades de baja prevalencia de origen autosómico recesivo ocasionadas por mutaciones en los genes que codifican para las enzimas lisosomales NAGLU y GALNS, respectivamente, y que provocan trastornos que afectan gravemente la expectativa y calidad de vida de quienes las padecen. A nivel mundial, la MPS IIIB tiene una prevalencia de 1,62 por 100.000 nacidos vivos [14], mientras que la MPS IVA tiene una prevalencia cercana a 1:250.000 nacidos vivos [15]. En el caso particular de Colombia, según el más reciente reporte emitido por el Sistema de Vigilancia Epidemiológica del Instituto Nacional de Salud (SIVIGILA), para la MPS IIIB se han reportado 18 casos, mientras que la MPS IVA es la segunda enfermedad de depósito lisosomal más frecuente en el país con 180 casos reportados para el 2020 y una prevalencia de 0,3 por cada 100.000 habitantes [16]. A pesar de que las MPS son enfermedades monogénicas, es muy común observar una heterogeneidad en los fenotipos, progreso de la enfermedad y respuesta a las terapias, por lo que la asociación genotipo y fenotipo no es absoluta. En este sentido, se ha propuesto que la regulación epigenética juega un papel importante en diferentes aspectos en los EIM, campo que recientemente ha ganado atención en el área de las enfermedades de depósito lisosomal [9, 17]. Sin embargo, para las MPS, y específicamente para las MPS IIIB y IVA, no se dispone de información sobre los cambios en el perfil epigenético producidos como resultado de la alteración metabólica presente en cada una de estas enfermedades. La falta información sobre el rol de la regulación epigenética en la expresión génica en las MPS IIIB y IVA limita la comprehensión de las bases moleculares y celulares de estas enfermedades, afectando así el desarrollo de nuevas alternativas de tratamiento o la mejora de las que actualmente se encuentran en uso. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha venido trabajando en el desarrollo de diferentes alternativas terapéuticas para EIM, especialmente para las enfermedades de depósito lisosomal [18-20], así como en el estudio de las bases moleculares y celulares de algunas de estas enfermedades [21-23]. Para el caso específico de la MPS IVA se han desarrollado proyectos relacionados con la producción de la enzima recombinante, terapia génica, chaperonas farmacológicas [18, 20] y recientemente se ha comenzado a trabajar en la evaluación de estrategias de edición genómica; mientras que para el caso de MPS IIIB en el último año se comenzó con la producción de la enzima y la identificación de chaperonas farmacológicas. Sin embargo, es necesario contar con información que permita ampliar el conocimiento sobre las bases moleculares y celulares de estas enfermedades, con el objetivo de facilitar el desarrollo y optimización de futuras terapias. En este sentido, en el presente proyecto se busca caracterizar el perfil epigenético asociado a las MPS IIIB y IVA al describir los cambios en el perfil de marcas epigenéticas asociadas a la represión (metilación del DNA -meCpG- y trimetilación de la histona H3 en su lisina 9 - H3K9me3) o inducción de la expresión génica (acetilación de la histona H3 en su lisina 14 - H3K14ac), así como el efecto del tratamiento mediante terapia de reemplazo enzimático o con un inhibidor de histonas desacetilasas. La ejecución del presente proyecto permitirá generar conocimiento básico sobre el papel de algunos mecanismos epigenéticos en las MPS. Esta información puede ser relevante para el desarrollo de posibles intervenciones para el tratamiento de MPS, y se espera que permita sentar las bases para estudiar el impacto de epigenética en otros errores innatos del metabolismo. Adicionalmente, la ejecución de este proyecto contribuirá a la integración de una investigadora postdoctoral a la comunidad científica colombiana, así como a la generación de una colaboración internacional con una investigadora de la Universidad de Purdue.