Control Epigenético del gen SOX9 en células de SERTOLI humanas: Identificación de proteínas modificadoras de la histona H3.

El sexo fenotípico de un individuo es el resultado de un proceso complejo que culmina con la diferenciación de los conductos internos y de los genitales externos bajo la influencia de genes y hormonas determinantes del sexo (1). El establecimiento del sexo durante el desarrollo de los mamíferos consiste en tres etapas o niveles secuenciales: La primera es el sexo genético o cromosómico que ocurre como consecuencia de la fertilización, donde el ovocito contribuye con un cromosoma sexual X, mientras que el espermatozoide aporta alguno de los dos cromosomas sexuales, X o Y (2).La segunda etapa corresponde a la determinación sexual gonadal, en la cual ocurren procesos moleculares guiados por una serie de genes característicos, que encaminan a la gónada indiferenciada o bipotencial entre la 6-7 semana gestacional, hacia su diferenciación en ovario o testículo (3). En la gónada bipotencial los genes WT1, DAX1, SF1, LHX9, LIM1, PAX2, GATA4, EMX2, WNT4 se expresan en las crestas gonadales XY y XX, allí es donde la dosificación génica y niveles de expresión de diferentes factores de transcripción serán los determinantes de la diferenciación gonadal, encargándose de activar las vías testículo-específica u ovario-específica (Figura 1) (3,4). La tercera etapa corresponde a la diferenciación sexual anatómica que; se refiere a la diferenciación del tracto y los genitales externos. En este proceso juegan un papel muy importante las hormonas producidas en el tejido gonadal (5). Específicamente la formación testicular depende del gen SRY, ubicado en el brazo corto del cromosoma sexual Y cercano a la región pseudoautosómica que codifica para el factor de transcripción SRY (5). Las mutaciones o la pérdida de la función del gen SRY resultan en la reversión sexual masculina a femenina (6). De igual manera se ha reportado que la expresión de SRY en individuos XX por translocación cromosómica es responsable del 10% de reversiones sexuales femeninas a masculinas y que las mutaciones en el gen SRY son responsables del 15% de casos de disgenesia gonadal en individuos 46,XY (7). El segundo gen con un rol importante en la diferenciación sexual masculina es SOX9, ubicado en la el cromosoma 17 (17q24.3) (8), quien codifica para un factor de transcripción importante en el desarrollo esquelético y la diferenciación sexual masculina. SOX9 está involucrado en la diferenciación de células de Sertoli, células sustentaculares encontradas en los túbulos seminíferos dando soporte estructural y metabólico a las células durante la espermatogénesis, y en la diferenciación de las células de Leydig en la producción de testosterona y secreción de la hormona anti-mulleriana (hormona que induce la retracción de conductos femeninos) (9). Se ha descrito que la activación de SOX9 se produce por la acción conjunta de las proteínas SRY y SF-1 sobre la región TESCO (del inglés Testicular Enhancer Specific of Sox 9 Core). De igual manera se ha establecido que la proteína SOX9 puede unirse a su propio promotor, modulando su propia expresión (9,10). De otra parte, en la diferenciación sexual femenina la ausencia del factor de transcripción SRY se traduce en una incapacidad de alcanzar el umbral crítico de expresión de SOX9. Esto acompañado de la expresión de factores de transcripción como RSPO1, WNT4 y FOXL2 que conducen a la formación de ovario (11,12,13). Los Trastornos del desarrollo sexual TDS son un grupo de condiciones congénitas caracterizadas por el desarrollo de un fenotipo sexual alterado, que afectan a 1 de cada 1000 a 4500 recién nacidos vivos por año, representando una emergencia tanto en salud como a nivel social (14). Los pacientes que padecen un TDS presentan discordancias entre su sexo gonadal, anatómico y/o cromosómico, por lo cual en la mayoría de los casos al momento del nacimiento no es posible establecer un género a causa de ambigüedades genitales o incluso pacientes que presentan un sexo anatómico normal, pero que manifiestan otro tipo de alteraciones como amenorrea o incluso infertilidad debido a la presencia de tejido gonadal del sexo contrario (TDS 46,XX o TDS 46,XY) o mixto (TDS ovotesticular) (15). Con el advenimiento de la epigenética y la regulación transcripcional, en los últimos años se ha establecido que al igual que las mutaciones, la expresión aberrante de genes tales como SOX9, puede estar mediando el desarrollo del fenotipo sexual anormal de estos pacientes (16). La epigenética hace referencia a los cambios en la expresión génica sin alterar la secuencia de ADN (17). Esta regulación de la expresión es mediada por una serie de mecanismos entre los cuales se destaca la que modificación covalente de histonas hace referencia a las modificaciones postraduccionales que pueden sufrir los residuos de aminoácidos ubicados en los extremos N-terminales de las histonas que conforman los nucleosomas (12). Estas modificaciones pueden ser acetilaciones, metilaciones, fosforilaciones y ubiquitinaciones. Cada modificación es catalizada por enzimas con funciones acetiltransferasas (HAT), deacetiltransferasas (HDAC), metiltransferasas (HMTs), demetiltransferasas (KDMTs), entre otras (12). De la regulación transcripcional de SOX9 en humano se sabe que además de su región promotora, existen tres regiones regulatorias (enhancer) descritas por el grupo de Croft y colaboradores en el año 2018 (18). Estas regiones han sido denominadas: eSR-A, eSR-B y e-ALDI. eSR-A fue reportada en cuatro pacientes, dos de los cuales por duplicaciones con formación de tejido ovotesticular y cariotipo 46,XX; y los otros dos por deleciones que causaban reversión sexual 46,XY . De igual manera, el enhancer eSR-B fue reportado en 6 casos de TDS, en los cuales cuatro presentaban duplicaciones y formación de tejido testicular con cariotipo 46,XX; y los dos restantes por deleciones y reversión sexual 46,XY (18). Finalmente, el enhancer eALDI fue detectado por ser una zona con alta actividad transcripcional y cercano a la región homóloga del ratón TESCO. Los enhancer del gen SOX9 en humanos son esquematizados en la Figura 1 (18). En humanos, los mecanismos epigenéticos que comandan la regulación transcripcional de SOX9 aún no se conocen con claridad. Se ha establecido que la regulación de su expresión puede estar determinada por el factor de transcripción SRY y que adicionalmente este puede interactuar con la enzima modificadora de histonas WDR5. Esta enzima tiene la función de trimetilar los residulos de lisina de la histona H3 H3K4Me3 (marca activadora) (19). A pesar de lo anterior, no hay reportes de otras modificaciones covalentes histonas en las regiones promotoras y reguladoras de SOX9. En el presente proyecto se pretende demostrar la contribución de las enzimas acetilasas GCN5/PCAF, P300 y la metiltranfserasa WDR5 en la actividad transcripcional del gen SOX9 en células de sertoli, como enzimas responsables de las modificaciones covalentes de los residuos de lisina 4, 9 y 27 de la histona H3, asociadas a las tres regiones enhancer y al promotor de SOX9. El cumplimiento de éste objetivo permitirá establecer los mecanismos epigenéticos responsables de la activación de SOX9 en células de sertoli y a su vez permitirá identificar las enzimas involucradas en dichos cambios epigenéticos.