Biorremediación de suelos contaminados con toxafeno: Optimización de los procesos en condiciones anaeróbicas y aeróbicas.

El toxafeno es un insecticida que está constituido por una mezcla compleja de aproximadamente 1000 terpenos bicíclicos policlorados. Fue incluido en la primera lista de contaminantes orgánicos persistentes (COP) prohibidos por el convenio de Estocolmo (Vetter y Oehme 2000; Korytár et al. 2003; Kapp y Vetter 2009). Hasta la mitad de los años ochenta, el toxafeno fue uno de los plaguicidas más usados tanto en Colombia, así como en el resto del mundo. Se conocen varios sitios en Colombia que están contaminados con este insecticida (MAVDT 2007, 2010). Normalmente estos sitios están relacionados con el cultivo de algodón. Como consecuencia de una crisis económica en este cultivo, una gran cantidad de toxafeno se volvió obsoleto. Parte de este fue enterrado bajo tierra sin ninguna medida de seguridad, mientras que otra parte fue almacenada inadecuadamente en las bodegas de Cenalgodón ubicadas en el municipio de El Copey, Cesar. Esto produjo la contaminación de suelos y aguas con concentraciones que llegan hasta 10.000 mg*Kg-1 (MAVDT 2007, 2010; Arbeli et al. 2015). La presente propuesta está orientada a desarrollar una solución a la contaminación de suelos por toxafeno en Copey por medio de la biorremediación, estrategia que podría ser replicada en otras partes de Colombia o el mundo que estén contaminadas con este insecticida. Entre las generalidades de la biodegradación de compuestos organoclorados, se ha determinado que los compuestos que presentan mayor número de cloros son más susceptibles a la degradación anaeróbica (deshalogenación reductiva); por otra parte, entre menor sea el número de cloros, estos son más susceptibles a la degradación aeróbica (p.e. deshalogenación oxidativa) (Fetzner 1998; Haggblom y Bossert 2003; van Pée y Unversucht 2003). Por lo tanto, para remediar sitios contaminados con mezclas de este tipo de compuestos, es ventajoso emplear procesos que combinen ciclos anaeróbicos y aeróbicos (Haggblom y Bossert 2003; Bunge y Lechner 2009; Arbeli 2009; Payne et al. 2013; Pathiraja et al. 2019). En la actualidad hay pocos estudios sobre la biotransformación de toxafeno. En dichos estudios se ha mostrado que condiciones anaeróbicas favorecen su transformación, donde los congéneres con mayor número de cloros sufren deshalogenación reductiva que conlleva a la acumulación de congéneres de 6 y 7 cloros como Hx-Sed y Hp-Sed (Miskimmin et al. 1995; Fingerling et al. 1996; de Geus et al. 1999; Buser et al. 2000). Adicionalmente, solo hay un reporte sobre transformación bacteriana aeróbica de toxafeno (Clark y Matsumura 1979). Esta transformación se llevó a cabo con una cepa de Pseudomonas con capacidad de degradar camfor. De igual manera, en un proyecto anterior realizado en USBA-PUJ, cultivos inoculados con biosólidos y enriquecidos en condiciones aeróbicas con camfor como única fuente de carbono, mostraron transformación de toxafeno cuando había camfor presente. En los controles que tenían solo toxafeno, o toxafeno con glucosa, no se observó transformación (Prieto 2015). Por esta razón es probable que la transformación aeróbica de toxafeno llevada a cabo por degradadoras de camfor sea catalizada por el citocromo P450cam que cataliza el primer paso de la degradación de camfor (Poulos y Raag 1992; Grogan et al. 2002; Eaton y Sandusky 2009; Omura 2010). Sin embargo, hasta la fecha no hay pruebas de esta hipótesis. En ambos estudios (Clark y Matsumura 1979; Prieto 2015), los cromatogramas mostraron disminución de picos con mayor tiempo de retención, probablemente congéneres con mayor número de cloros (Korytár et al. 2003) y aumento en el área de picos con menor tiempo de retención, probablemente congéneres con menor número de cloros. Esta observación va en contravía con la teoría de que la degradación aeróbica de moléculas organocloradas es más favorable con moléculas de menor número de cloros. Dado que también la degradación anaeróbica es selectiva para moléculas con mayor número de cloros, no es claro si estos dos procesos son complementarios como el caso de otras moléculas policloradas. Este desconocimiento, está reflejado en el hecho de que existen tecnologías que aplican exclusivamente condiciones anaeróbicas y otros que recomiendan ciclos anaeróbicos-aérobicos (Rubin y Burhan 2006). Sin embargo, existe muy poca información sobre las ventajas de incluir una etapa aeróbica. Lacayo et al. (2004), evaluaron la remoción de toxafeno en dos reactores secuenciales (anaeróbico-aérobico). La mayoría del toxafeno fue removido por el primer reactor (anaeróbico) mientras que la contribución del segundo reactor (aerobio) no fue evidente. Por todo lo anterior, la presente propuesta busca ampliar el conocimiento (a nivel mundial) sobre la degradación de toxafeno intentando responder las siguientes preguntas: Primera pregunta: ¿Cuáles bacterias y enzimas están involucradas en la transformación reductiva y oxidativa de toxafeno? Hasta la fecha se ha reportado transformación de toxafeno por 2 cepas puras (Dehalospirillum multivorans (Ruppe et al. 2003, 2004) y Enterobacter sp. D1 (Lacayo et al. 2005)) en condiciones anaeróbicas, y una cepa de Pseudomonas en condiciones aeróbicas. Sin embargo, no se han realizado estudios independientes de cultivo para determinar si estas bacterias efectivamente son importantes a nivel de campo, ni cuáles son los genes asociados a la transformación. En un proyecto anterior se establecieron cultivos de enriquecimiento con capacidad de transformar toxafeno en condiciones aeróbicas y otros cultivos en condiciones anaeróbicas. Los cultivos de enriquecimiento posen menor diversidad microbiana, y se espera que estén enriquecidos con bacterias que benefician la transformación (Arbeli et al. 2006; Iasur et al. 2010). Por esta razón proponemos evaluar mediante secuenciación masiva de amplicones del gen ARNr-16S, cuales bacterias proliferan en presencia de toxafeno o camfor y posiblemente participan en su transformación. De igual manera se realizará la secuenciación del metagenoma de estos cultivos para evaluar la presencia de genes como deshalogenasas reductivas o citocromo P450 que posiblemente participan en la transformación. La identificación de microorganismos y enzimas involucradas en la transformación aeróbica y anaeróbica de toxafeno serviría para conocer la fisiología y requerimientos nutricionales de los transformadores. Está información ayudara a optimizar las condiciones para la biorremediación de suelos contaminados. Segunda pregunta: ¿Cuáles son los productos de transformación reductiva y oxidativa de toxafeno? Se sabe que en sedimentos anaeróbicos se acumulan congéneres de 6 y 7 cloros como Hx-Sed y Hp-Sed pero no se sabe si estos subproductos siguen siendo degradados (Buser et al. 2000; Ruppe et al. 2003; 2004). Actualmente no existen reportes sobre la transformación de toxafeno en cultivos de enriquecimientos anaeróbicos y sería importante evaluar si los cultivos establecidos en la PUJ logran transformar estos congéneres y producir metabolitos con menor números de cloros (5 o menos) que posiblemente pueden ser mineralizados más fácilmente. En condiciones aeróbicas, no hay ningún reporte sobre identificación de los congéneres de toxafeno que son más susceptibles a la transformación oxidativa ni sobre los subproductos de transformación, y no se sabe cuántos cloros tienen estos subproductos y si efectivamente fueron oxidados con grupos de oxígeno. Esta información sería importante para estudios futuros que evalúen el comportamiento ambiental y la toxicidad de estos subproductos. Tercera pregunta: ¿Cómo se puede aumentar la transformación de toxafeno para remediar suelos contaminados con el insecticida? En un proyecto anterior (Arbeli et al. 2015) se probaron 17 tratamientos en microcosmos de suelos contaminados de Copey con diferentes aditivos bajo condiciones aeróbicas, anaeróbicas y ciclos anaeróbicos-aeróbicos, donde la mejor transformación de toxafeno se observó en presencia de biosólidos, melaza y hierro-cero-Valente en condiciones anaeróbicas. En una prueba piloto, el porcentaje de remoción de toxafeno se aumentó notablemente (hasta 49%), probablemente por el hecho de que se aumentó la concentración de biosólidos y melaza. Sin embargo, la transformación de toxafeno se detuvo después de 168 días, y en el resto del tiempo (hasta el día 495) no se observó transformación adicional. Por lo anterior, es necesario seguir optimizando los tratamientos tanto anaeróbicos como aeróbicos para aumentar el porcentaje de remoción de toxafeno. En condiciones anaeróbicas se evaluarán diferentes concentraciones de melaza, biosólidos y hierro-cero-Valente ya que en el proyecto anterior estos componentes tenían efecto positivo sobre la transformación de toxafeno. Además, dado que la concentración de este insecticida en los suelos del Copey es muy elevada, se evaluará está concentración inhibe la transformación de toxafeno por efecto tóxico. En microcosmos aeróbicos de suelos se evaluará la adición de biosólidos y diferentes concentraciones de camfor. De igual manera se determinará si hojas aromáticas como eucaliptus y cipres, pueden reemplazar el uso de camfor, ya que estas hojas pueden tener terpenos (Hernandez et al. 1997), y serían un sustituto más económico y ambientalmente más aceptable. Finalmente se evaluará si los productos de transformación anaeróbica son sujetos a transformación aeróbica adicional. Para responder a estas preguntas se estableció un grupo con experiencia en microbiología ambiental, biodegradación y biorremediación, ingeniería química, metagenómica y bioinformática. Los ensayos de laboratorio se realizarán en la PUJ, los análisis bioinformáticos se realizarán en el servidor de la Universidad del Rosario, y la caracterización de los subproductos de degradación en el centro de metabolómica de la Universidad de Los Andes. Las respuestas a estas preguntas ayudaran a diseñar un proceso de biorremediación de suelos contaminados con toxafeno en el muni