Biodegradación anaeróbica de Pentaeritritol Tetranitrato (PETN) como única fuente de carbono y nitrógeno

Los explosivos son compuestos químicos, utilizados tanto en los conflictos armados, así como en la industria civil en construcción, la exploración de petróleo y la minería. Estos compuestos se liberan al ambiente en las aguas residuales de las plantas de fabricación, como residuos que se quedan después de la detonación, así como por lixiviación a partir de dispositivos no detonados (Juhasz y Naidu 2007; Stenuit y Agathos 2010; Kalderis et al. 2011). Dado que en general los explosivos son persistentes y tóxicos, la contaminación de suelos y cuerpos de agua conlleva a consecuencias negativas para la salud humana y los ecosistemas. Además, la existencia de dispositivos no detonados presenta un riesgo adicional de detonación no controlada (Juhasz y Naidu 2007; Stenuit y Agathos 2010; Kalderis et al. 2011).Pentaeritritol Tetranitrato (PETN) es un explosivo de la familia éster de nitrato. El PETN es utilizado como detonador para iniciar la reacción de otros explosivos más potentes como el TNT, la dinamita y algunos explosivos plásticos. Por otro lado, este compuesto se ha utilizado como producto farmacéutico para tratar la angina de pecho y otros trastornos cardiacos. PETN este fabricado en Colombia y ha sido utilizado en el conflicto armado, así como en actividades de explotación minera y petrolera. Actualmente, ya existen evidencias de suelos contaminados por PETN en el país (Arbeli et al., 2016), y es de esperar que existen otros ambientes impactados. Existen muy pocos reportes acerca de la biodegradación de este explosivo y hasta el momento se han reportado en la literatura solo 2 cepas, Enterobacter cloacae PB2 y Agrobacterium radiobacter, que degradan PETN en condiciones aeróbicas (Binks et al., 1996; White et al., 1996). De igual forma, existen reportes limitados sobre la degradación anaeróbica de PETN por cultivos de enriquecimiento y en proceso de biorremediación anaeróbica de suelos contaminados (Zhuang et al., 2012; 2014). Tanto en condiciones aeróbicas como en condiciones anaeróbicas los estudios actuales señalan que las bacterias degradadoras requieren una fuente de carbono externo para poder degradar el PETN utilizando el explosivo como fuente de nitrógeno, y posiblemente (solo en condiciones anaeróbicas) como aceptor final de electrones (Binks et al., 1996; White et al., 1996; Zhuang et al., 2012; 2014). En condiciones aeróbicas, Bink y colaboradores (1996) mostraron que durante la degradación, se liberan solo 2 grupos de nitritos, generando pentaeritritol trinitrato y pentaeritritol dinitrato. Hasta la fecha no se ha reportado la utilización de PETN como fuente de carbono. Sin embargo, un estudio reciente mostró la utilización y degradación de una molécula menos compleja pero estructuralmente similar (trinitroglicerol) (Husserl et al., 2010), aparentemente resultado de una evolución reciente de una nueva ruta metabólica (Husserl et al., 2012).Las enzimas responsables de la degradación aeróbica del PETN fueron aisladas de Enterobacter cloacae PB2 y Agrobacterium radiobacter (French et al., 1996; Snape et al., 1997) y se ha mostrado que enzimas similares están involucrados en la degradación de trinitroglicerol (Snape et al., 1997; Blehert et al., 1999; Husserl et al., 2012). Estas flavo-enzimas son parte de la familia OYE (Old Yelow Enzyme), y tienen 68.8% de similitud y 48.9% de identidad entre sí (Snape et al., 1997). Esta familia de enzimas es sintetizada por bacterias, levaduras y plantas (Williams y Bruce, 2002). Estudios a nivel enzimático, tanto con PETN y con trinitroglicerol, indican que estas enzimas liberan grupos de nitrito dejando como producto final pentaeritritol dinitrato o glycerol mononitrates, respectivamente, reafirmando que este compuesto no ha sido utilizado como fuente de carbono (French et al., 1996; Snape et al., 1997). En el caso de Arthrobacter sp. JBH1, la primera bacteria que mineraliza trinitroglicerol utilizando esta molécula como fuente de carbono y nitrógeno, la transformación de trinitroglicerol a mononitroglicerol esta catalizado por una enzima de la familia OYE denominada PfvC, mientras que la desnitración de mononitroglicerol es catalizada por otra enzima denominada mononitroglicerol kinase (MngP) (Husserl et al., 2012).La enzima PETN reductasa de Enterobacter cloacae PB2 ha sido estudiada con mayor detalle (por ejemplo: Khan et al., 2002, 2004; Toogood et al., 2011). Esta enzima puede metabolizar diversos explosivos de diferentes familias tales como nitratos de éster (PETN, nitroglicerol), nitro aromáticos (TNT), 1,3,5-triazinas (1,3,5-trinitro-1,3,5-triazociclohexano conocido como RDX), así como otras sustancias muy distintas como 3-cetoesteroides (prednisona y 1,4-androstadieno-3,17-diona) (Barna et al; 2001; Khan et al., 2002; Williams et al., 2004). Por esta razón, el interés biotecnológico en esta enzima y sus posibles aplicaciones en la industria va más allá que la degradación de explosivos.Los mismos metabolitos (pentaeritritol trinitrato y pentaeritritol dinitrato), fueron observados también en condiciones anaeróbicas, aunque es estas condiciones, Zhuang et al., (2012) pudieron identificar además pentaeritritol monotrato y pentaeritritol, aumentando la posibilidad de utilizar el PETN como fuente de carbono. Sin embargo, como fue mencionado, el cultivo anaeróbico fue suplementado por fuente de carbono adicional. Además, ninguna bacteria fue aislada en este estudio y hasta el momento no se conocen bacterias anaeróbicas que degradan PETN, ni se conoce las enzimas que participan en la degradación. Interesantemente, existen estudios que muestran la actividad anaeróbica de la enzima PETN reductasa con otros sustratos. Los autores de estos estudios señalan que condiciones anaeróbicas favorecen la actividad de estas enzimas ya que el oxígeno puede oxidar el flavín mononucleótido y muestran que en ausencia de oxígeno, puede cambiar el porcentaje de los enantiomeros producidos por esta enzima (Fryszkowska et al., 2012). Por lo que se conoce hasta ahora, la actividad anaeróbica de esta enzima con PETN no ha sido investigada.En la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental se ha estudiado por varios años la biodegradación de explosivos, principalmente de 2,4,6-trinitrotolueno (TNT), 2,4-dinitrotolueno (DNT) y Pentaeritritol Tetranitrato (PETN). Estos estudios fueron orientados al desarrollo de detonadores biodegradables, así como biosensores para la detección de explosivos, tales como minas antipersonas. De igual manera, estos estudios son importantes para entender el comportamiento ambiental de estas sustancias, las rutas metabólicas, las enzimas que participan en su degradación y la manera de acelerar su degradación en sitios contaminados.De las 3 sustancias arriba mencionadas, la información en la literatura internacional respecto a la degradación de PETN es la más escasa. En los estudios realizados en nuestro grupo de investigación, se ha mostrado que el PETN puede ser aún más persistente que el TNT (Arbeli et al., 2016). Se aislaron varias bacterias aeróbicas que degradan PETN como única fuente de nitrógeno en presencia de fuente de carbono adicional (Ávila, 2011) y se observó que TNT puede inhibir la degradación de PETN (Roldan et al., 2013). Por otro lado, en condiciones anaeróbicas con fuente de carbono se logró mostrar una degradación simultánea de TNT y PETN (Gracia, 2014). Finalmente, y tal vez el más novedoso de nuestros resultados, fue la observación por primera vez de degradación anaeróbica de PETN en cultivos de enriquecimiento, sin la adición de una fuente de carbono ni de nitrógeno (Gracia, 2014). En este último estudio se aislaron consorcios de bacterias constituidos de 2-3 cepas, que degradaron PETN en condiciones anaeróbicas como única fuente de carbono y nitrógeno. Lamentablemente, estos consorcios no fueron conservados de manera adecuada y se encontraron últimamente como inviables.En el estudio anterior no se identificaron los metabolitos orgánicos de la degradación. Además, aunque se detectó liberación de nitritos, este fue en baja concentración y no se puede explicar una desnitración completa del PETN, como es de esperar en el caso que PETN fuera utilizado como una fuente de carbono. Por ejemplo, en la mineralización aeróbica de dinitrotolueno y trinitroglicetina con una fuente de carbono y nitrógeno se puede observar, respectivamente, la liberación de 2 y 3 moles de nitritos por cada mole de explosivo (Spanggord et al., 1991; Husserl et al., 2010). Esto debido a que los organismos necesitan una relación entre carbono y nitrógeno de aproximadamente 10:1, mientras que la relación entre carbono y nitrógeno en PETN es aproximadamente 1:1. El hecho que en nuestros experimentos no se observó acumulación de nitritos podría ser explicado por una ruta metabólica distinta donde se libera nitrato o amonio que no fueron evaluados en el estudio. Alternativamente, es posible que los nitritos liberados fueron utilizados como aceptor de electrones, proceso conocido como desnitrificación. Por estas razones, en esta propuesta de investigación se propone aislar las bacterias que degradan PETN en condiciones anaeróbicas en medio mineral con PETN como única fuente de carbono y nitrógeno. Además, se propone estudiar con mayor detalle los metabolitos producidos en el proceso, la generación de biomasa a partir de PETN e intentar identificar enzimas que posiblemente participan en la degradación. Para lograr estas metas se construyó un grupo interdisciplinar con integrantes de los departamentos de biología (para aislar las bacterias, estudios de biodegradación y análisis genómico) y química (para identificar los metabolitos que se generan en el proceso). Esta información tiene alto valor científico por su novedad. Asimismo, el conocimiento de la ruta metabólica es importante para entender el comportamiento de la molécula en el ambiente y puede ayudar a diseñar estrategias para estimular el proceso en sitios contaminados.