Análisis funcional de RNAs Largos no codificantes (LncRNA) de astrocitos humanos a partir de Secuenciación RNA-seq

Resumen Las enfermedades neurodegenerativas (EN) se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de neuronas y otras células cerebrales, a partir de alteraciones funcionales en el sistema nervioso central (SNC) (1). Los pacientes con EN presentan síntomas clínicos variables, incluyendo pérdida de función cognitiva (como memoria y lenguaje), alteraciones motoras y psiquiátricas, entre otros; lo que hace de las EN causas comunes de morbilidad y deterioro cognitivo en adultos mayores (2). Los factores de riesgo más comunes para el desarrollo de EN son la edad, la inflamación, la obesidad y algunas alteraciones genéticas (3,4). La especificidad del diagnóstico de las EN es muy baja debido a algunas similitudes en sus síntomas tempranos, junto con la gran variabilidad clínica, lo que hace ineficiente e imprecisa la implementación de esquemas de tratamiento en el desarrollo temprano de las EN (5). Actualmente, un campo de estudio en crecimiento es el de los ARN no codificantes (LncRNA), cuya importancia ha sido descrita en varios procesos biológicos que juegan un papel fundamental en la regulación de la diferenciación celular, el desarrollo, la proliferación y la apoptosis (6,7). Uno de los enfoques de estos nuevos estudios trata de establecer relaciones entre la desregulación de los LncRNA presentes solo en pacientes de ciertas enfermedades para considerarlos biomarcadores, y en el caso específico de algunos tipos de neurodegeneración (ND) los LncRNA han cobrado gran importancia en el desarrollo de alternativas para diagnosticar con precisión las EN (7,8) . Estudios recientes de muestras de sangre y tejido cerebral post mortem de pacientes con enfermedad de Parkinson y Alzheimer demostraron una expresión diferencial de LncRNA como Sox2OT, BC200, BACE1-AS y NAT-Rad18 y miARN como miR-1, miR-22p, miR-26b-3p y miR-28-3p (9–13). De acuerdo con lo anterior, se ha demostrado que éstas alteraciones juegan un papel significativo en: el control de la expresión de genes relacionados con la ND y cambios en las redes o vías de señalización implicadas en las funciones fisiológicas celulares con su consecuente manifestación fenotípica por lo que los lncARN han sido considerados como posibles dianas celulares y farmacológicas que permitirían predecir y tratar las EN antes de la manifestación de síntomas clínicos y el inicio del deterioro funcional (10-15). En adición a lo anterior, una ventaja de estas moléculas es su estabilidad y presencia en biofluidos como sangre, saliva, orina y líquido cefalorraquídeo (16-18), lo que posibilita su fácil obtención e identificación para un diagnóstico precoz y más efectivo (19-21). Teniendo en cuenta el hecho de que las alteraciones en los lncRNAs se han asociado a EN específicas, su identificación y posterior estudio se ha dificultado debido a limitaciones técnicas y experimentales. En respuesta a estos desafíos, estudios recientes han implementado modelos avanzados de aprendizaje automático para abordar ensayos complejos, realizar análisis multiparamétricos de alto contenido e interpretar conjuntos de big-data aplicados a la salud mental. Este enfoque podría permitir un diagnóstico más preciso y temprano de cada EN sobre la base del historial médico y los perfiles moleculares del endotipo del paciente. El aprendizaje automático (Machine Learning ML) es una herramienta de informática de inteligencia artificial (IA), diseñada para simular el aprendizaje de la inteligencia humana a partir de los datos obtenidos y aprendizaje orientado (22). Esta tecnología requiere la integración de múltiples conjuntos de datos de información biológica, lo que permite la creación de un modelo estadístico que ayuda a predecir algún parámetro desconocido (23). En los últimos años, el ML ha ganado un papel clave en la medicina, ayudando a la detección de patologías como cáncer o en la terapia con medicamentos. El ML puede contribuir a la clasificación de tumores o a la predicción de respuestas farmacológicas personalizadas según el perfil de expresión génica (24-27). En el caso de las EN, el uso de ML se enfoca en encontrar cambios específicos en la expresión génica que permitan el diagnóstico precoz del trastorno (22). Por lo tanto, un gran conjunto de datos de lncRNA desregulados en pacientes con algún tipo de ND pueden usarse como biomarcadores potenciales y emplearse en algoritmos de aprendizaje automático. De esa forma, se puede crear un modelo para detectar cada enfermedad, avanzando en el diagnóstico con mayor precisión. Un modelo ampliamente usado para el estudio de las EN es el de los astrocitos humanos, dada su influencia directa en la función cerebral y su relación con el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas (28). Por ejemplo, los astrocitos mantienen la homeostasis cerebral durante alteraciones metabólicas, detectando nutrientes, hormonas y otros metabolitos. En el caso de ácido palmítico (PA), estudios anteriores han demostrado que, al ser detectado, este reduce la captación de glucosa y la liberación de lactato por parte de los astrocitos; induce la generación de especies reactivas de oxígeno; aumenta la producción de citocinas proinflamatorias; disminuye la viabilidad celular en cultivos de astrocitos por apoptosis e impide la autofagia (29). Además, la obesidad y las dietas con alto contenido de grasas han sido correlacionadas con alteraciones en el sistema nervioso central (30) haciendo del estrés lipotóxico en astrocitos un buen modelo para estudiar e identificar biomarcadores de EN. Previamente, con recursos de financiación externa aportados por Minciencias (ID: 7425) y con el apoyo de: The Mayo Clinic Alzheimers Disease Genetic Studies, dirigida por el Dr. Nilufer Ertekin-Taner y el Dr. Steven G. Younkin; Mayo Clinic, Jacksonville, FL y the Mayo Clinic Brain Bank (NIA grants P50 AG016574, R01 AG032990, U01 AG046139), el laboratorio de bioquímica computacional y estructural de la Universidad Javeriana, realizó el primer análisis de perfil transcriptómico global de astrocitos humanos expuestos a estrés lipotóxico como modelo de inflamación; y su amplio uso como modelo para el estudio de las mismas. A partir de este trabajo el equipo de investigación publicó los siguientes artículos: Análisis sobre la relación entre obesidad y las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, mostrando evidencia de la relación entre estrés del Retículo endoplasmático (ER) y obesidad así como el impacto en la progresión de EN (31), 2) Mecanismos moleculares que regulan los desórdenes asociados al estrés de ER en astrocitos (32), 3) Análisis de los diferentes modelos del metabolismo de astrocitos, incluyendo las reconstrucciones a escala genómica desarrolladas en los últimos años (33), 4) Desarrollo de la reconstrucción metabólica a escala genómica de astrocito humano más completo reportado en la literatura(34). Este modelo fue usado para modular diferentes rutas metabólicas después de un insulto con PA (35), 5) Estudio de la respuesta astrocitaria a un insulto por PA a través de un análisis de balance de flujo y minería de datos para evaluar los flujos metabólicos en condiciones patológicas (36), 6) evaluación de los efectos de PA y el uso de tibolona como posible protector en astrocitos humanos (37), 7) estudio de expresión diferencial de astrocitos humanos en respuesta a estrés lipotóxico causado por PA (Transcriptome-wide profiling of palmitic acid-exposed human astrocytes reveals widespread immuno-metabolic dysregulation; en revisión por Molecular Neurobiology) y 8) El rol emergente de los LncRNA en enfermedades neurodegenerativas a partir de aproximaciones como Machine Learning (Aceptado en Biomolecules, in press) Como resultado de estos estudios y de la secuenciación global del transcriptoma, identificamos 111 LncRNA altamente expresados; de los cuales un alto porcentaje aún no han sido reportados en la literatura o asociados con procesos de inflamación en células cerebrales o el potencial desarrollo de EN. De acuerdo con lo anterior, el presente proyecto tiene como problema central la necesidad de aportar evidencia experimental y computacional que permita identificar y caracterizar los LncRNAs diferencialmente expresados en astrocitos humanos bajo condiciones lipotóxicas a partir de secuenciación de alto rendimiento (RNAseq); adicionalmente, se plantea explorar el interactoma astrocitario en búsqueda de patrones de co-expresión que permita avanzar en el estudio de LncRNAs como potenciales biomarcadores y/o dianas para el diagnóstico de estas EN. Nuestra investigación presenta una perspectiva novedosa para la dilucidación de los procesos moleculares y epigenéticos relacionados a la neurodegeneración, ofreciendo un protocolo computacional para el estudio de lncRNAs.