Análisis del transcriptoma hepático para la Identificación de respuestas moleculares a la exposición a hidrocarburos aromáticos policíclicos en el pez Aequidens metae.

El desarrollo constante de la industrialización, la urbanización y la modernización agrícola, ha provocado la contaminación progresiva de suelos y cuerpos de agua con metales pesados (Chen et al. 2012), plaguicidas (Aichner et al. 2007), hidrocarburos (Bortey-Sam et al. 2014) y otros contaminantes. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) son ubicuos y abundantes en el ambiente, constituyen un grupo de moléculas compuestas por dos o más anillos de benceno fusionados (Manzetti, 2013). Estos contaminantes se liberan de una amplia gama de industrias y actividades cotidianas asociadas al uso del petróleo, así como la combustión de petróleo y biomasa (Collier et al. 2013). Los HAP de origen petrogénico, proceden de actividades de perforación y extracción, liberación de aguas de producción, derrames y contaminación de sitios industriales y refinerías. Estas fuentes poseen HAP de bajo peso molecular enriquecidos con moléculas de 2 a 3 anillos como naftaleno, antraceno y fenantreno. Los HAP de origen pirogénico están asociados a la contaminación del tráfico, actividades industriales e incineración y están enriquecidos con moléculas de alto peso molecular con 4 o más anillos, tales como pireno y benzo[apireno (Boehm et al. 2008; Lima et al. 2005; Manzetti, 2013). El destino ambiental de los HAP está relacionado con su baja solubilidad, baja biodisponibilidad, alta persistencia, así como procesos de adsorción y desorción (Cheng y Wong, 2006). Su resistencia a la degradación está relacionada con la naturaleza fuerte de los enlaces aromáticos (Wan et al. 2007), y como consecuencia pueden persistir y acumularse en el medio ambiente y en la biota (Soclo et al. 2008). Su naturaleza hidrofóbica y lipofílica les confiere muy baja solubilidad en agua y en ambientes acuáticos tienden a asociarse rápidamente con la materia particulada que termina en la sedimentación (Qiu et al. 2009). La contaminación ambiental de los HAP es preocupante por su toxicidad aguda, genotoxicidad, mutagenicidad y carcinogenicidad (Manzetti, 2013). Los organismos acuáticos se encuentran entre los principales blancos de los HAP debido a su vulnerabilidad a los contaminantes lipofílicos que tienden a acumularse en sus tejidos alcanzando concentraciones elevadas e interfiriendo en sus procesos bioquímicos (Uno et al. 2009). En este sentido los peces bentónicos (como Aequidens metae), son especialmente sensibles a la contaminación por moléculas hidrofóbicas como los HAP. Por otro lado, estos peces son buenos bioindicadores de la presencia de contaminantes que ya no están en el agua, o aquellos cuya presencia o uso es intermitente (Oros y Ross, 2005). Acumulan contaminantes en sus tejidos, que alcanzan concentraciones mucho más altas que las del agua, esto los hace bioindicadores idóneos de exposición a HAP (Das y Chakrabarty, 2007). Los efectos potenciales de los HAP sobre los peces son de especial interés porque estos animales ocupan posiciones clave en las redes tróficas acuáticas y terrestres. Son víctimas de numerosas especies, incluidos otros peces, aves piscívoras, humanos y otros mamíferos. Por lo tanto, los cambios en las poblaciones de peces pueden traducirse en cambios en otras poblaciones que dependen de ellos como alimento (Logan, 2007). En peces y demás vertebrados, la biotransformación de compuestos lipofílicos en el hígado es necesaria para la desintoxicación y la excreción de diferentes toxinas. Dicha biotransformación se clasifica en reacciones de fase I y II (Livingstone, 1998). Las enzimas monooxigenasas, de la familia de citocromo P450 son las principales enzimas oxidativas en el metabolismo de la Fase I, capaces de catalizar la biotransformación oxidativa de la mayoría de los contaminantes lipofílicos (Zanger y Schwab, 2013). Sus productos pueden convertirse en metabolitos reactivos aumentando su toxicidad, mutagenicidad o carcinogenicidad (Baillie y Rettie, 2011). Uno de los principales mecanismos tóxicos relacionados con la exposición a HAP y la activación de citocromos P450, es el incremento en el estrés oxidativo por la formación en exceso de especies reactivas de oxígeno, las cuales pueden oxidar y alterar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (Van der Ost et al. 2003). Algunos hidrocarburos policíclicos planares como fenantreno y benzo[apireno, así como dioxinas, furanos y bifenilos policlorados interactúan con el receptor de hidrocarburo de arilo (AhR), desencadenando la inducción de citocromo P-4501A (CYP1A). La inducción de esta isoenzima juega un papel clave en la biotransformación de estos contaminantes (Sarkar et al. 2006). Por otro lado, la actividad de etoxi-resorufina-O-deetilasa (EROD) describe la tasa de deetilación mediada por CYP1A de un sustrato de éter de fenoxazona 7-etoxiresorufina, que conduce a la formación de resorufina. La actividad catalítica hacia este sustrato es un indicador funcional de la cantidad de CYP1A presente en una muestra de tejido (Whyte et al. 2008). Sin embargo, la inducción del CYP1A no indica exclusivamente la acción tóxica provocada por compuestos orgánicos (Hooper et al. 2013); por consiguiente, en los estudios de vigilancia ambiental, deben utilizarse enfoques con marcadores múltiples que brinden la oportunidad de correlacionar efectos diferentes y obtener una imagen más integral del impacto de los contaminantes (Asker et al. 2015). En este sentido, las tecnologías "ómicas" tales como genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, se han aplicado para determinar las alteraciones genómicas funcionales que han permitido la identificación de los efectos adversos y los modos de acción de sustancias potencialmente tóxicas (Sauer et al. 2017), contribuyendo con la caracterización de los mecanismos de adaptación de los organismos (Yang et al. 2013) y con la identificación de genes candidatos a la exposición a xenobióticos (Qian, 2014). A diferencia del genoma, que es relativamente estable, el transcriptoma varía con el estadio de desarrollo, la condición fisiológica y el ambiente externo. Así, la transcriptómica facilita la comprensión de los mecanismos que están involucrados en la respuesta global de un organismo (o un tejido) a la contaminación ambiental (Qian et al. 2014). Adicionalmente, al identificar los genes que aumentan o disminuyen su transcripción, se pueden generar hipótesis sobre las rutas de transformación hepáticas de los contaminantes y su efecto sobre el organismo. Por ejemplo, en hígado de peces marinos expuestos a hidrocarburos la sobreexpresión de los genes cxcl14, adipoq, bmp4, ppard y pik3ip fue asociada con la inhibición de la proliferación de hepatocitos y descenso en la biotransformación de sustratos endógenos y exógenos mediante la catálisis de la fase I y II (Sevior et al. 2012; Xu et al. 2017), mientras que la sobreexpresión de los genes (tg, nkx2.1, pax8, hhex) fue vinculada a la regulación del eje hipotalámico-pituitario-tiroideo (alteración endocrina) (Kim et al. 2016). Actualmente, la secuenciación de RNA (RNA-seq) es el método transcriptómico más robusto, facilita analizar la respuesta en conjunto a gran profundidad y permite medir los cambios en el transcriptoma en organismos en los que no hay información de secuencia disponible al inicio del estudio (Hook et al. 2014). RNASeq ha permitido comprender los mecanismos de respuesta ecotoxicológica en estudios de expresión génica a partir de la integración de datos sobre efectos biológicos como respuesta adaptativa a la exposición subletal a hidrocarburos (García et al. 2012; Sørhus et al. 2017; Vega-Retter et al. 2018). En estudios de monitoreo ambiental en aguas continentales sobre la respuesta transcriptómica en peces expuestos a diferentes hidrocarburos disueltos en agua o asociados a sedimentos, fue asociada la sobreexpresión de genes relacionados con biotransformación, bioenergética, regulación iónica, balance de fluidos y síntesis del colesterol, con el metabolismo oxidativo, el estrés oxidativo, la apoptosis y la función inmune (Wiseman et al. 2013; Hook et al. 2010; Sørhus et al. 2017). Sin embargo, estos estudios no fueron realizados en condiciones controladas y a partir de mezclas de hidrocarburos, por consiguiente, dificultan la atribución de los cambios de la expresión transcripcional a la exposición a hidrocarburos o a una molécula determinada. Por esta razón es necesario realizar en paralelo ensayos controlados en el laboratorio utilizando moléculas específicas. En la Orinoquia, a causa de la abundante explotación petrolera, los hidrocarburos depositados en el lecho de los cuerpos de agua lenticos y lóticos de esta región se encuentran los HAP y entre estos, fenantreno y benzo[apireno, considerados altamente tóxicos y asociados a procesos de bioacumulación en peces bentónicos (McCarthy et al. 2003; Soclo et al. 2008; Zhang et al. 2015). Uno de los peces bentónicos que poseen hábitos alimenticios detritívoros más abundantes y fácilmente detectable en la región es Aequidens metae. Además, este pez ocupa un lugar intermedio en la cadena trófica y es un vector potencial de biomagnificación. Finalmente, este pez tolera los contaminantes en concentraciones similares a las observadas en el medio ambiente contaminado, sin efectos letales y se adapta a las condiciones de laboratorio. En este contexto, el Grupo de Investigación en Biotecnología y Toxicología Acuática y Ambiental (BioTox) de la Universidad de los Llanos (grupo co-ejecutor de esta propuesta) propuso el pez A. metae, como potencial bioindicador de la exposición a contaminantes ambientales (Corredor et al. 2016). Por consiguiente, el estudio del transcriptoma hepático en la especie íctica nativa Aequidens metae permitirá identificar genes candidatos que sirvan como biomarcadores centinelas de la exposición a HAP y los posibles mecanismos asociados a su biotransformación y toxicidad. Este estudio será pionero en el análisis transcriptómico de los cambios en la expresión génica en respuesta a la exposición a hidrocarburos arom