Optimización, clonación y expresión de los genes codificantes para Manganeso peroxidasa y Lignino peroxidasa de Phanerochaete chrysosporium, bajo el control del promotor GAP en Pichia pastoris

En los últimos años se han incrementado de manera considerable la necesidad y el interés en la implementación de procesos industriales y biotecnológicos amigables con el planeta, la producción de energías limpias y renovables, y la producción de biocombustibles a partir de biomasa lignocelulósica [Linares et al., 2018. No obstante, varias industrias siguen generando compuestos altamente to¿xicos (xenobio¿ticos) que son vertidos al medio ambiente accidental o deliberadamente sin control; por ejemplo, fenoles, fenoles halogenados (utilizados como plaguicidas, herbicidas, fungicidas o insecticidas), hidrocarbonos aromáticos policíclicos (PAHs), dioxinas o colorantes sinte¿ticos, entre otros. En ambos casos, tanto para la producción de energías renovables y biocombustibles a partir de material lignocelulósico, como para el tratamiento de compuestos contaminantes, las peroxidasas fúngicas han mostrado ser de gran utilidad [Lambertz et al., 2016. Las peroxidasas son oxidorreductasas que catalizan una gran variedad de reacciones, incluyendo la reducción de peróxidos, como el peróxido de hidrógeno, y la oxidación de compuestos orgánicos e inorgánicos. Son hemo proteínas que contienen hierro y protoporfirina como grupos prostéticos y su peso molecular varía entre 30 y 150 kDa [Bansal & Kanwar, 2013. En este grupo, se incluyen las Manganeso peroxidasas, MnP (EC 1.11.1.13) y Lignino peroxidasas, LiP (EC 1.11.1.14), secretadas principalmente por hongos de podredumbre blanca, conocidos por su capacidad para degradar material lignocelulósico y la remoción de compuestos recalcitrantes tóxicos; siendo Phanerochaete chrysosporium uno de los organismos más estudiados [Janusz et al., 2013; Harms et al., 2011. Se ha visto que las peroxidasas son capaces de modificar xenobio¿ticos dando lugar a compuestos de baja o ninguna toxicidad, promoviendo incluso la mineralizacio¿n parcial de algunos de ellos [Janusz et al., 2013. Las MnP, requieren Mn2+ para cerrar el ciclo catali¿tico y lo oxidan a Mn3+; el cual, al formar un quelato con a¿cidos orga¿nicos sintetizados por los hongos, actu¿a como oxidante difusible (quelatos estables con E°= 0.9¿1.2 V). A trave¿s de este mecanismo mediado, la MnP es capaz de degradar diversos compuestos feno¿licos en el proceso de descomposicio¿n de la lignina de la pared celular vegetal, aunque no puede oxidar directamente las unidades no feno¿licas de e¿sta. Adicionalmente, el Mn3+ generado en la reacción también puede iniciar la peroxidacio¿n de li¿pidos insaturados generando radicales libres capaces de degradar di¿meros no feno¿licos [Jensen, et al., 1996. Por otra parte, las LiP se caracterizan por su capacidad para oxidar di¿meros de tipo no feno¿lico que constituyen la lignina y otros compuestos aroma¿ticos de alto E°, y despolimerizar la lignina sinte¿tica en presencia de alcohol veratri¿lico (AV) [Wei & Xianghua, 2009. A pesar de las ventajas biotecnolo¿gicas potenciales que ofrecen las peroxidasas de alto E°, como las MnP y LiP, au¿n no se han podido aplicar a nivel industrial, debido a los obstáculos encontrados a la hora de expresarlas funcionalmente con niveles elevados en hospederos apropiados y de fácil manipulación. Esto podría deberse a que se trata de proteínas glicosiladas y estructuralmente complejas, que contienen cuatro puentes disulfuro, dos calcios estructurales y un grupo hemo, haciendo difícil su plegamiento correcto y la expresio¿n funcional. El uso de levaduras como hospederos para la expresión heteróloga de proteínas es ventajoso en términos de tiempo y esfuerzo en comparación con los hongos filamentosos, por lo que la expresión heteróloga y constitutiva en levaduras resulta en una alternativa viable para la producción de peroxidasas a mayor escala, bajo costo y en concentraciones superiores a las secretadas naturalmente por los hongos filamentosos. Adicionalmente, las levaduras superan a los hongos filamentosos en cuanto a velocidades de crecimiento, lo que representa una ventaja en términos de producción y facilidad en la manipulación genética, junto con la habilidad para llevar a cabo modificaciones postraduccionales específicas de eucariotas, como son, procesamiento proteolítico, formación de puentes disulfuro y glicosilaciones (fundamentales para la actividad de las MnP y LiP). La producción de levaduras es económica, presenta altos rendimientos y son poco exigentes en términos de tiempo de cultivo y esfuerzo en procesos de manipulación. Adicionalmente, debido a la naturaleza unicelular de las levaduras, resulta más fácil el proceso de escalado y cultivo en biorreactor, en comparación con los hongos filamentosos que pueden afectar la reología del cultivo y quedar atrapados en las turbinanas usadas para la agitación [Wei & Xianghua, 2008. En cuanto a la trayectoria del grupo de investigación, desde hace varios años se están desarrollando investigaciones que conducen al la producción de enzimas recombinantes y su uso en el tratamiento de distintos contaminantes. En este sentido, en trabajos anteriores desarrollados por el grupo de investigación GBAI se han clonado y expresado en Pichia pastoris, enzimas ligninolíticas como las Lacasas POXA 1B de Pleurotus ostreatus y GlLCC1 de Ganoderma lucidum; donde ambas enzimas fueron expresadas usando el promotor constitutivo GAP [Rivera-Hoyos et al., 2015. Adicionalmente, se evaluó la capacidad de la levadura recombinante productora de POXA 1B para remover los contaminantes presentes en licor de pulpeo Kraft, donde se concluyó que, aunque la lacasa está involucrada en la disminución de las unidades de color, DQO y DBO5, es necesaria la acción conjunta de varias enzimas ligninolíticas para disminuir la toxicidad de dicho efluente [Rivera-Hoyos et al., 2018. Por esta razón, con el presente proyecto se pretende llevar a cabo la optimización de las secuencias, clonación y la expresión los genes de MnP y LiP de P. chrysosporium para implementar el uso de microorganismos recombinantes de crecimiento rápido (P. pastoris) en la producción de peroxidasas recombinantes. El objetivo a mediano plazo es utilizar una mezcla de varias enzimas ligninolíticas recombinantes para favorecer la degradación no sólo de los contaminantes presentes en el licor de pulpeo Kraft, sino también poder evaluar su capacidad en la remoción de otros compuestos recalcitrantes. Finalmente, es importante destacar que hasta el momento no se cuenta con reportes en donde se hayan optimizado las secuencias de los genes de LiP y MnP de P. chrysosporium, para favorecer su expresión en P. pastoris, bajo la regulación del promotor GAP (constitutivo). Por otra parte, en los sistemas de expresión para LiP y MnP disponibles comercialmente no se ha usado P. pastoris, lo que representa una novedad en términos de investigación y abre nuevas oportunidades en el campo de la industria biotecnológica, por ejemplo, para el tratamiento de efluentes contaminados usando tecnologías verdes y amigables con el planeta.