Identificación de los factores virales e inmunológicos determinantes de la patogenicidad y de la protección de infecciones virales de importancia para la salud: Virus Dengue y Rotavirus

Resumen ejecutivo Problema Científico En este proyecto estudiaremos los factores virales e inmunológicos determinantes de la patogenicidad y de la protección de infecciones virales de importancia para la salud: virus dengue (DENV) y rotavirus (RV) en un modelo múrido. El papel de los LB en la patogenia de la enfermedad por DENV no es claro. Con el presente proyecto caracterizaremos en un modelo múrido de infección por DENV, los LB-DENV de serotipo 1 y 2 (DENV-1 y DENV-2) y relacionaremos su presencia con la inducción de algunos signos de enfermedad al reto con un virus heterólogo (de un serotipo diferente al usado para la infección primaria). Los factores genéticos virales que determinan la patogenicidad y la respuesta inmune local (intestinal) al RV son pobremente conocidos. En este proyecto, usando un método novedoso para generar RV recombinante (RecRV), crearemos virus que expresan eGFP (una proteína fluorescente que facilita el estudio de las células infectadas) genéticamente vinculada a variantes seleccionadas de los genes virales NSP3 y NSP1. Con estos RecRV evaluaremos, en un modelo múrido neonatal, la hipótesis de que estas dos proteínas desempeñan un papel importante en la capacidad del RV para replicarse en el intestino, causar diarrea (virulencia), diseminarse extra-intestinalmente, ser más o menos inmunogénico e inducir una respuesta inmune protectora. Recientemente, se mostró que los LT que se localizan en los tejidos no linfoides (llamados LT residentes de memoria (LTRM) son una población muy importante para la protección contra los patógenos y virus en particular (22) y que su frecuencia en estudios previos se había subestimado enormemente (de 10 a 100 veces) por razones técnicas (23). Con el desarrollo del presente proyecto caracterizaremos los LTRM específicos de RV y pondremos a prueba la hipótesis que el desarrollo de los LTRM intestinales (LTRMI) específicos de RV reguladores que expresan LAP son dependientes del TGF-beta para su desarrollo, pero no los que no expresan LAP. Así mismo, evaluaremos la protección inducida por un RV heterólogo en ausencia de LTRMI por eliminación de estos con la administración de NAD+. Así, determinaremos, por primera vez en la literatura mundial, el papel de los LTRMI en la inmunidad contra un virus y estableceremos la dependencia o no de la generación de éstos al TGF-beta en una infección viral. Objetivo General: Identificar los factores virales e inmunológicos determinantes de la patogenicidad y de la protección de infecciones virales de importancia para la salud: virus dengue y rotavirus. Objetivos Específicos: 1. Determinar los factores de patogenicidad de virus dengue y rotavirus en un modelo múrido. 2. Caracterizar la respuesta inmune inducida por virus dengue y rotavirus en un modelo múrido. 3. Caracterizar los mecanismos de protección inmunológicos inducidos por virus dengue y rotavirus en un modelo múrido. Aproximación metodológica El estudio de mecanismos virales e inmunológicos de infecciones humanas es muy difícil debido a que no se tiene control sobre el momento de la infección y es imposible obtener muestras de diferentes órganos de humanos infectados. Por lo anterior, es necesario usar modelos animales. En la presente propuesta desarrollaremos un modelo múrido de infección con DENV y continuaremos usando el modelo de enfermedad por RV y el modelo de vacunación con RV que ya están estandarizados en nuestro laboratorio. Modelo de infección por DENV: se inoculan ratonas adultas C57BL/6 intraperitonealmente (IP) con varias dosis de DENV-1 y DENV-2. Modelo de enfermedad por DENV: aunque solo utilizando ratones inmunodeficientes se obtiene un modelo de enfermedad severa, usaremos un modelo de enfermedad leve (hepatitis y plaquetopenia) al inocularlos IP con un serotipo de DENV y retarlos con una cepa de diferente serotipo (infección secundaria heteróloga). Para cuantificar y caracterizar los LB-DENV por citometría de flujo usamos partículas similares a virus (VLP, por su sigla en inglés) de DENV-1 y DENV-2. La cuantificación del ARN viral se hace por PCR y los anticuerpos específicos de los dos serotipos son determinados por ELISA y ensayos de neutralización. La enfermedad se evalúa con cuantificación de enzimas hepáticas y plaquetas en plasma. Modelo de enfermedad por RV: se inoculan ratones C57BL/6 neonatos por vía oral con una cepa de simio (heteróloga, RRV) y se evalúa la presencia de diarrea. Modelo de protección por RV: ratones C57BL/6 neonatos se vacunan con RRV, se retan 12 días después con una cepa de ratón (homóloga, EC) y se evalúa la excreción del RV en heces durante 10 días. Los RVRec, en un fondo genético de SA11-L2, que expresen la proteína eGFP acoplada a la NSP3 o NSP1 de RV múrido, de forma individual o combinada serán generados por nuestros colaboradores internacionales. La cuantificación del ARN viral se hace por PCR, la replicación de los RVRec en las células inmunes se identifica con microscopio confocal. La caracterización de la respuesta inmune innata inducida por los RVRec se hace cuantificando ARNm de varias citocinas por PCR y la de la adaptativa evaluando las frecuencias de LT y anticuerpos específicos de RV. Los LTRMI se identifican por citometria de flujo y su dependencia de TGF-beta y de alfa4beta7 se evalúa mediante la administración a los ratones de anticuerpos específicos. El cumplimiento de los objetivos se alcanzará al: 1) Comparar la capacidad para generar hepatitis, plaquetopenia y diseminación de DENV-1 y DENV-2 en ratones adultos inmunocompetentes después de infección primaria y secundaria homóloga (con el mismo serotipo de la primaria) o heteróloga. 2) Cuantificar y establecer la importancia de la replicación de DENV en el desarrollo de los LB-DENV 3) Caracterizar los LB-DENV y los anticuerpos circulantes específicos de DENV-1 y DENV-2 durante la fase aguda y convaleciente de respuestas primarias y secundarias homólogas y heterólogas. 4) Evaluar el papel de los LB-DENV heterólogos en el incremento de la susceptibilidad a la enfermedad por DENV. 5) Usando RVRec de forma individual o combinada evaluaremos el papel individual o combinado de NSP3 y NSP1 en la: a) replicación intestinal y la virulencia (capacidad de inducir diarrea) de un RV heterólogo en ratones neonatales. b) la replicación extra-intestinal de un RV heterólogo en ratones neonatales e identificar las células en las que se está replicando el RVRec. c) la capacidad de un RV heterólogo para inducir respuestas inmunes innatas y adaptativas en ratones neonatales. d) la capacidad de un RV heterólogo para inducir protección contra el reto con un RV múrido en ratones neonatales. 6) Comparar la frecuencia, el fenotipo y la dependencia del TGF-beta para la generación de los LTRMI y esplénicos específicos de RRV. 7) Determinar si los LTRMI específicos de RRV dependen para su desarrollo de la migración a intestino mediada por alfa4beta7. 8) Evaluar la capacidad de protección inducida por RRV en ratones a los que se les ha inhibido o no la migración intestinal de los LT y LB con el anticuerpo contra alfa4beta7. 9) Determinar si al eliminar los LTRMI con la administración de NAD+ se disminuye la protección ante el reto con el virus homólogo. Resultados y productos esperados: Con los resultados obtenidos propondremos: 1) Propuestas para la prevención eficaz de las consecuencias de la infección por DENV. En particular, se espera que la medición de los LB-DENV en forma serotipo específica pueda servir como un factor pronóstico en pacientes con DENV. Según los resultados obtenidos, el ensayo de cuantificación de LB-DENV desarrollado en el actual proyecto puede ser directamente usado en la clínica para tal fin. 2) Nuevas estrategias para mejorar las vacunas actuales y la generación de nuevas vacunas eficaces contra RV. En particular se espera poder proponer: a) Estrategias para desarrollar vacunas vivas contra RV más seguras e identificar en las que se están usando en la actualidad las razones por las cuales son atenuadas. b) Estrategias para mejorar la inmunogenicidad y capacidad protectora de las vacunas. En particular se espera saber si estrategias que inhiban el TGF-beta y/o los LT que expresan LAP pueden mejor la inmunogenicidad y protección de las vacunas en uso. Los productos esperados son: 1. Se formarán un estudiante de doctorado y uno de maestría. 2. Se publicarán tres artículos en revista indexada internacional con revisión por pares. 3. Se presentarán los resultados en cinco congresos 3 nacionales y 2 internacionales.