Expresión heteróloga de factores de virulencia de la cepa bacteriana Photorhabdus akhurstii SL0708 y evaluación de su potencial para el control de plagas agrícolas.

Project: Research

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El sector agrícola se enfrenta a importantes desafíos debido al calentamiento global, la creciente demanda de alimentos y el uso de agroquímicos perjudiciales para el medio ambiente y la salud humana. Por lo tanto, es esencial desarrollar estrategias biotecnológicas que impulsen la transición hacia sistemas de producción más sostenibles, con menos huella de carbono, y más limpios para el ecosistema, el productor y el consumidor, contribuyendo a mitigar los efectos negativos de estos problemas a nivel global. Además, la prevalencia de plagas y enfermedades en los sistemas agrícolas representa grandes pérdidas en la producción de alimentos y se espera que aumente debido a la crisis ambiental ​(1)​. En respuesta a esta problemática, como una estrategia ambientalmente amigable para el control y manejo integrado de plagas, se ha implementado el uso de enemigos naturales como agentes microbianos de control biológico (AMCB). Sin embargo, los bioplaguicidas basados en AMCB tienen aún una baja participación en el mercado debido a algunas desventajas que presenta esta biotecnología. Por ejemplo, los productos basados en hongos y virus entomopatógenos requieren una gran cantidad y estabilidad del agente biológico activo para generar una tasa de mortalidad suficiente para el control poblacional del insecto y, a su vez, presentan tiempos de acción lenta, permitiendo que el insecto blanco permanezca activo, ocasionando daños irreversibles en los cultivos ​(2–4)​. Estas características restringen la producción a nivel industrial de estos bioplaguicidas ​(5)​. De allí, que estudios previos han propuesto estrategias basadas en la producción, por técnicas de ADN recombinante, de toxinas y factores de virulencia microbianos para incrementar la actividad insecticida de los AMCB ​(6-9)​. Además de contribuir en aumentar la eficiencia de los AMCBs, éstas permiten producir altos niveles de proteínas bioactivas, o incluso combinarlas para buscar efectos sinérgicos, pudiendo incluso ser formuladas directamente como bioplaguicidas (10). Estos enfoques biotecnológicos contribuyen a una agricultura más sostenible ambiental y económicamente, al ser más específicos y seguros para la salud, biodegradables y menos dependientes de productos de síntesis química.​​ Como ejemplos de éxito están las proteínas Cry recombinantes, derivadas de Bacillus thuringiensis, o más recientemente el uso de otros factores de virulencia de origen microbiano (mucin-proteasas, proteínas de unión a quitina, quitinasas, estromelisina-1, gelatinasa A, la catepsina-L, entre otras) como aditivos en la formulación de bioplaguicidas o su potenciación ​(8 - 12)​. Las bacterias del género Photorhabdus, son enterobacterias Gram negativas que viven en simbiosis con nemátodos entomopatógenos y son las responsables de la actividad insecticida a través de una gran diversidad de toxinas y otros factores de virulencia expresados (13 - 16). El grupo de investigación “Biología de plantas y sistemas productivos” de la Pontificia Universidad Javeriana, logró aislar de suelos agrícolas el nemátodo Heterorhabditis bacteriofora SL0708 así como su bacteria simbionte Photorhabdus akhurstii SL0708, caracterizando la actividad patogénica de este sistema frente a diferentes plagas de importancia agrícola (17 - 20). Recientemente, se logró secuenciar y anotar el genoma de la cepa P. akhurstii SL0708 (21), lo que permitió identificar genes codificantes de múltiples factores de virulencia, entre los cuales se encontraron genes codificantes de quitinasas (Chi, del inglés Chitinase) y proteínas de unión a quitina (Cbp, del inglés Chitin Binding Protein) que podrían emplearse para potenciar la actividad entomopatógena de un AMCB. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es producir de forma recombinante la quitinasa Pa-Chi2A y la proteína de unión a quitina Pa-CBP de P. akhurstii SL0708, como bioproductos con actividad potencial insecticida y destinados a aumentar la actividad patogénica de un AMCB sobre larvas de insectos plaga. Para ello, se diseñarán estrategias de producción recombinante enfocadas en dos biosistemas de expresión heteróloga: Escherichia coli y células de insecto Sf9 asistidas por BEVS (Baculovirus Expression Vector Systems) y posterior purificación de las proteínas recombinante empleando cromatografía de afinidad con iones inmovilizados (IMAC). El perfil funcional de las proteínas será evaluado in vitro (actividad quitinolítica) mediante ensayos ELISA e in vivo a través de bioensayos para determinar tanto la actividad insecticida oral como el efecto potenciador de las proteínas recombinantes sobre la actividad insecticida de Beauveria bassiana como modelo de AMCB, contra tres tipos de larvas de insectos plaga: Galleria mellonella, Diatraea saccharalis y Spodoptera frugiperda. Con este proyecto colaborativo entre la Universidad Javeriana y la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria – Agrosavia, se espera caracterizar por primera vez el perfil funcional de factores de virulencia relacionados con la degradación de quitina derivados de la cepa colombiana P. akhurstii SL0708, obtenidos en dos sistemas de expresión heteróloga con fines comparativos, lo que permitirá articular y optimizar métodos para la selección y evaluación de factores de virulencia y compuestos bioactivos como potenciadores de actividad insecticida de AMCB. Esta investigación constituye un complemento importante para el desarrollo de la propuesta de tesis doctoral titulada “Expresión de proteínas recombinantes en células y larvas de insecto utilizando un aislamiento colombiano de nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda (SfCOL)”, en la cual se espera generar una plataforma de expresión de proteínas recombinantes basada en un baculovirus nativo, y que a su vez, se buscará validar a través de un análisis comparativo de la expresión y caracterización funcional de diferentes tipos de proteínas de interés en control biológico obtenidas en esta y otras diferentes plataformas de expresión. El presente proyecto contribuirá significativamente en esta validación, al aportar dos proteínas recombinantes adicionales, con origen biológico diferente, a evaluar en el marco de la plataforma de expresión desarrollada en la tesis doctoral.
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  • In Execution

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  • Pontificia Universidad Javeriana