Evaluación del efecto terapéutico del sistema de edición génica CRISPR/nCas9 acoplado a magnetoliposomas en un modelo animal de la mucopolisacaridosis IVA

RESUMEN EJECUTIVO Las mucopolisacaridosis (MPS) constituyen un grupo amplio de enfermedades metabólicas de carácter hereditario caracterizadas por mutaciones monogénicas que afectan la actividad de enzimas que contribuyen a la degradación de glucosaminoglicanos (GAGs) al interior del lisosoma. En el caso particular de la MPS IVA, o enfermedad de Morquio A, alteraciones en la actividad catalítica de la enzima N-acetilgalactosamina-6-Sulfatasa (GALNS) promueven la acumulación de queratán sulfato y condroitín 6-sulfato; un evento que confluye en la aparición de alteraciones motoras, disfunción esquelética, hiperflexibilidad articular, opacidad corneal y complicaciones cardiacas. Aunque la MPS IVA es una patología de baja prevalencia (0,3 para cada 100.000 habitantes en Colombia), los individuos que la padecen, así como sus familiares enfrentan una severa disminución en su calidad de vida. A pesar de la importante morbi-mortalidad que podría suponer esta patología, en la actualidad no existe una terapia eficiente que permita corregir el defecto enzimático que conlleva a la acumulación subcelular de intermediarios metabólicos. Por lo anterior, la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas se hace necesaria y es allí donde el uso de la terapia génica (TG) cobra particular interés gracias a la posibilidad de introducir a la célula un gen con actividad terapéutica haciendo uso de vectores virales o no virales. En este sentido, el uso de técnicas de edición génica como CRISPR/Cas9 y la generación de vectores diseñados desde la nanobiotecnología han supuesto un nuevo panorama para el tratamiento de este grupo de afecciones. Bajo este contexto, durante este proyecto se pretende evaluar in-vivo una estrategia de terapia génica basada en CRISPR/Cas9 asociada a un vector no viral basado en magnetoliposomas empleando un modelo animal de la MPS IVA. Los resultados de esta investigación permitirán generar información relevante en cuanto al diseño, estabilidad e implicaciones terapéuticas de la edición génica en el tratamiento de esta enfermedad, que podría ser extendido al tratamiento de otros errores innatos del metabolismo. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La mucopolisacaridosis IVA (MPS IVA) es un error innato del metabolismo producido por mutaciones en el gen que codifica para la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS), ubicado en el cromosoma 16q24.3. La deficiencia total o parcial de la actividad enzima GALNS lleva a la acumulación de queratán sulfato y condroitín-6-sulfato principalmente en tejido conectivo; evento que se manifiesta en alteraciones motoras, disfunción esquelética, hiperflexibilidad articular, opacidad corneal, y disfunción cardiaca [1, 2]. En la actualidad, la única alternativa terapéutica disponible para el manejo clínico de los pacientes es la administración intravenosa de la elosulfasa alfa como terapia de reemplazo enzimático (TRE) [3]. Sin embargo, la baja vida media de la enzima hace que se requieran administraciones semanales en centros especializados de infusión, por lo que la adherencia al tratamiento se ve comprometida [3] y puede reducir el acceso de esta terapia para pacientes ubicados en regiones apartadas de los centros de infusión. Sumado a lo anterior, evidencia reciente sugiere que el uso de esta terapéutica no tiene impacto en la velocidad de crecimiento de individuos tratados de forma temprana con la enzima, por lo que el uso de la elosulfasa alfa parece no ser eficiente para corregir las anormalidades del crecimiento en pacientes con MPS IVA [4]. Como consecuencia de lo anterior, han sido desarrolladas algunas estrategias que buscan superar las limitaciones de la TRE, entre las que se destacan la terapia enzimática de degradación de sustrato [5], el trasplante de células hematopoyéticas [6] y el uso de chaperonas farmacológicas [7]. Aunque estas alternativas pueden resultar interesantes, ninguna de ellas contempla la corrección del defecto genético que da lugar a la patología; por lo que el uso de terapia génica se ha planteado como una alternativa a largo plazo para el tratamiento de esta enfermedad [6]. Previamente se ha evaluado el uso de vectores virales para realizar terapia génica de adición, tanto en modelos celulares como animales de la MPS IVA, mostrando el potencial de esta estrategia [8-10]. Recientemente, se ha propuesto el uso de herramientas de edición génica como una estrategia para mejorar la duración y seguridad de la terapia génica[11]. Aunque el uso de las herramientas edición génica, como nucleasas con dedos de zinc (ZFN) o CRISPR/Cas9, se ha evaluado en otras MPS, a la fecha no existen reportes de su uso en la MPS IVA. Bajo estas premisas, la presente investigación busca establecer si el sistema de edición génica CRISPR/Cas9 acoplado a un vector no viral basado en magnetoliposomas tiene efecto terapéutico en un modelo animal de la MPS IVA. JUSTIFICACIÓN La MPS IVA es una patología poco frecuente (o enfermedad rara) de origen autosómico recesivo debido a mutaciones en el gen que codifica para la enzima lisosomal GALNS [1]. Como consecuencia de esta actividad disfuncional, la degradación de los GAGs queratán sulfato y condroitín 6-sulfato se ve comprometida; un evento que generan principalmente una displasia esquelética degenerativa [10]. A nivel mundial, la MPS IVA tiene una prevalencia de 1:250.000 nacidos vivos [12]. En el caso particular de Colombia, según el más reciente reporte emitido por el Sistema de Vigilancia Epidemiológica del Instituto Nacional de Salud (SIVIGILA), la MPS IVA es la enfermedad de depósito lisosomal más frecuente en el país con 180 casos reportados para el 2020 y una prevalencia de 0.3 por cada 100.000 habitantes [13]. Pese a lo anterior, para Cundinamarca y Boyacá se han reportado prevalencias cercanas a 0.7 por cada 100.000 habitantes sugiriendo que en algunas zonas del país podrían existir subregistros de la enfermedad [14]. A pesar de la baja prevalencia reportada para la MPS IVA, las complicaciones propias de la enfermedad resultan discapacitantes e incluso pueden comprometer la vida del paciente [10]. Si bien es cierto, desde el año 2014 fue aprobada la administración intravenosa de la elosulfasa alfa, desarrollada por la compañía farmacéutica Biomarin, como TRE [3], reportes recientes muestran que su uso incluso en edades muy tempranas (Antes de los 5 años) no mejora las alteraciones esqueléticas propias de la enfermedad [4]. Sumado a lo anterior en Colombia la administración de la elosulfasa alfa le cuesta al sistema de salud alrededor de 1.200 millones de pesos por paciente al año [15], por lo que el balance costo-beneficio supone una enorme inquietud entre la comunidad científica que ha propuesto incluso en retirar su administración del plan de beneficios en salud. Es por lo anterior que la búsqueda de nuevas y mejores alternativas terapéuticas se hace necesaria. Dado que el origen de la patología tiene un correlato directo con la presencia de mutaciones sobre el gen GALNS, el uso de terapia génica y de manera particular, la edición génica cobra particular interés [16]. La versatilidad y facilidad de uso de la herramienta génica CRISPR/Cas9, que tiene la capacidad de llevar a cabo desde el cambio de un nucleótido que se encuentre mutado hasta la inserción de un fragmento ADN, haciendo uso de la maquinaria de reparación celular, ha permitido que se convierta en la principal herramienta de edición génica en el momento [17, 18]. Para el caso de las MPS, esta estrategia se ha evaluado con éxito en la MPS I, mostrando la posibilidad de corregir una mutación puntual presente en el gen de la α-Iduronidasa en un modelo in vitro de fibroblastos [19], así como de la inserción del gen completo de la α-Iduronidasa en un locus seguro del genoma de un ratón MPS I [20, 21], haciendo uso de un sistema de entrega no viral basado en liposomas catiónicos, soportando que el uso de vectores no virales basado en liposomas catiónicos puede ser una estrategia interesante para la entrega de material genético [22]. Aunque estos resultados soportan la hipótesis de edición del genoma a nivel de un nucleótido, en patologías como la MPS IVA, en la cual se han descrito poco más de 360 mutaciones [23, 24], se hace poco provechoso utilizar esta aproximación. Ante la imperiosa necesidad de desarrollar proyectos de investigación básica y aplicada para la MPS IVA en nuestro país, en el presente proyecto se busca evaluar, en un modelo animal (ratón) de la MPS IVA, una estrategia de terapia génica basada en el uso de la herramienta de edición génica CRISPR/Cas9 mediante la integración del ADN codificante del gen GALNS en el locus ROSA26 y empleando un vector no viral basado en magnetoliposomas. Este proyecto dará continuidad al proyecto “Terapia génica para errores innatos del metabolismo empleando CRISPR/Cas9 y un sistema de entrega basado en magnetoliposomas” financiado por el Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación, y en el que se está diseñando y evaluando el uso de la herramienta CRISPR/Cas9 y el uso de magnetoliposomas en fibroblastos de pacientes MPS IVA. En este proyecto financiado por MinCiencia, se diseño un vector de expresión y unos ARNg, que permitirán mediar la inserción del casete de expresión en el locus AAVS1, presente exclusivamente en el genoma humano, y con lo que se espera generar información importante sobre el potencial de esta aproximación para el tratamiento de la MPS IVA y otras enfermedades de errores innatos del metabolismo. Con el propósito de evaluar en un modelo animal (ratón) el uso de CRISPR/Cas9 como alternativa de tratamiento para MPS IVA, en el presente proyecto se construirá un nuevo vector de expresión, y diseñaran nuevos ARNg, que permitan la inserción del casete de expresión en la región del locus ROSA26 del genoma de ratón, los cuales serán entregados, tanto in vitro como in vivo empleando los magnetoliposomas desarrollados en el proyecto financiado por MinCiencia. En este sentido, la ejecución del presente proyecto permitirá evaluar el efecto terapéutico del sistema en un modelo in vivo para la MPS IVA, generando información valiosa para el desarrollo de una nueva alternativa de tratamiento para esta enfermedad, que pueda ser posteriormente extendida para otros errores innatos del metabolismo o enfermedades de origen genético.