Evaluación del efecto genotóxico y la oxidación del ADN por exposición a cigarrillo electrónico en jóvenes vapeadores universitarios de Bogotá.

Justificación y Planteamiento del Problema Los cigarrillos electrónicos son considerados por un amplio número de personas como una alternativa segura e inocua ante el daño ampliamente conocido que ocasionan los cigarrillos convencionales sobre la salud, razón por la cual han sumado desde su ingreso al mercado, millones de usuarios a nivel mundial (1). A pesar de esto, el manejo y componentes de estos dispositivos es hasta el momento muy poco regulado y quienes incursionan en su uso, lo hacen bajo la premisa de “fumar” sin experimentar daños asociados a la práctica o lo visualizan como una terapia de remplazo. En contraste con la creencia popular, en 2019 el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (CDC) registró a finales de ese año, a lo largo de sus 50 estados, más de 2500 casos de lesiones pulmonares asociadas con el uso de cigarrillos electrónicos y sus productos relacionados (2). Tan solo hasta el 5 de noviembre de 2019 se habían reportado 39 muertes vinculadas al vapeo, lo que en su momento fue considerado una epidemia limitada a Estados Unidos, con pocos casos reportados y ninguna muerte en el resto del mundo (3). Este giro de la historia, ubicó en la mira de varias investigaciones a los cigarrillos electrónicos como dispositivos con potenciales riegos para la salud, reconociendo que este tipo de sistemas de entrega calientan una solución liquida o material seco para volatilizar sus componentes, los cuales son inhalados por los usuarios en forma de aerosol. Haciendo la precisión de que son estas soluciones liquidas, conocidas como e-líquidos (líquidos electrónicos), las que contienen aromatizantes o saborizantes de distinta naturaleza, que son considerados los agentes principalmente relacionados con la inducción de toxicidad en el tracto respiratorio, el sistema cardiovascular y circulatorio, el sistema esquelético, el sistema inmune, efectos adversos en el desarrollo, alergenicidad, genotoxicidad y alteraciones en la piel (1). Los vapores producidos por cigarrillos electrónicos y los e-líquidos con sabores inducen citotoxicidad, estrés oxidativo e inflamación, apreciándose en ratones aumento de citoquinas proinflamatorias y disminución de los niveles de glutatión en pulmones (4). Hay estudios que incluso sostienen que vapear resulta en una disminución de la expresión de un gran número de genes relacionados con la respuesta inmune por variaciones epigenéticas (5) y vinculan la fragmentación significativa que estos dispositivos generan sobre el ADN, como un riesgo para el desarrollo de procesos de carcinogénesis (6). Aun cuando hoy en día se ha comprobado la exposición a la nicotina en vapeadores y se ha corroborado la exposición pasiva a nicotina en los hogares de usuarios de cigarrillos electrónicos frecuentes (7), se sabe por ensayos experimentalmente controlados en líneas celulares, que independiente de la presencia de nicotina o sus metabolitos, las muestras expuestas a e-líquidos con saborizantes, continúan registrando baja viabilidad, aumento de producción de especies reactivas de oxígeno y apoptosis (8,9,10,11). Siendo los saborizantes los que han sido asociados a mutaciones y daño cromosómico con dependencia de la dosis y la composición (12,13); sin pasar por alto los estudios que reafirman que el grado de daño celular sigue siendo menor que el evidenciado por los cigarrillos convencionales (14,15,16). Si bien los estudios en materia de genética toxicológica a nivel de líneas celulares y en animales de experimentación son de suma importancia, no se deben ignorar las limitaciones que presentan para emitir respuestas del comportamiento epidemiológico, la susceptibilidad individual y la relación que se precisa entre la toxicocinética y la toxicodinamia, después de los eventos de activación metabólica y la intervención de tasas de distribución y eliminación, propia de la interacción de tejidos especializados. La carencia de investigaciones en poblaciones humanas que evalúen los efectos no deseados sobre la integridad del material genético y el posible incremento de los niveles de oxidación en el ADN por exposición a cigarrillo electrónico, constituyen la principal pertinencia de este estudio. Sumado al hecho de que en Colombia de acuerdo con la Encuesta Nacional de Tabaquismo en jóvenes, hay un preocupante incremento de consumo de cigarrillos electrónicos en universitarios y el III Estudio Epidemiológico Andino, establece una prevalencia para nuestro país de 12,8% (17). Este proyecto daría continuidad a un estudio iniciado en esta área dentro de nuestro grupo de investigación, en el que se demostró un efecto en la frecuencia de micronúcleos y se identificaron alteraciones epigenéticas relacionadas con la metilación del ADN. Con los nuevos resultados se pretende dar mayor robustez a los hallazgos en curso y evaluar los daños ocasionados en el ADN por una técnica más sensible a pequeñas roturas de cadena simple y doble que solo pueden ser evidenciadas con métodos que revelen escalas incipientes del daño como lo es ensayo de cometa. Pregunta de Investigación ¿Qué efectos genotóxicos y cambios en los niveles de oxidación del ADN son inducidos por el uso de cigarrillos electrónicos en jóvenes universitarios de Bogotá? Marco Teórico Los cigarrillos electrónicos son dispositivos de diseño y estructura variada empleados en el calentamiento de una sustancia, denominada comúnmente e-líquido, que al alcanzar cierta temperatura genera un aerosol que es inhalado por el usuario. Todos los cigarrillos electrónicos están conformados por cuatro componentes básicos: una batería que puede ser o no recargable usada en el calentamiento de una bobina, un cartucho para almacenar el e-líquido, un atomizador que convierte el e-líquido en aerosol y una boquilla de inhalación. Desde la introducción de estos en el mercado, tanto su apariencia externa como su construcción interna, ha estado continuamente evolucionando, por lo que los cambios sucesivos se conocen como generaciones (1). Hasta el momento existen cuatro generaciones de cigarrillos electrónicos. La primera generación la constituyen los dispositivos desechables que guardan una apariencia similar a los cigarrillos convencionales. La segunda generación son elementos de un mayor tamaño que tienen baterías y cartuchos recargables. La tercera generación se caracteriza por baterías de alta capacidad y herramientas de modificación de voltaje, con la posibilidad de conexión de tanques que con mayor almacenamiento de líquidos vaporizables y la cuarta generación, o “podmods” presentan cartuchos precargados o recargables que contienen líquidos denominados “pod” con sistemas modificables llamados “mod” (1). Por otra parte, los líquidos electrónicos son soluciones que contienen humectantes, agua, etanol y usualmente nicotina y saborizantes, aunque también pueden tener extractos de cannabis. Dentro de los humectantes se encuentran principalmente el propilenglicol y la glicerina vegetal (1). Se desconoce el número exacto de e-líquidos saborizados disponibles actualmente, sin embargo, se sabe que para 2019 había más de 19000 sustancias comercializables en el mercado y se emplean alrededor de 210 aromatizantes químicos diferentes para su fabricación, dentro de los que destacan componentes como: las aminas aromáticas, carbonilos, fenoles, benzopirenos, óxido nítrico, compuestos ciánicos, aminas, compuestos orgánicos volátiles, nitrosaminas específicas de tabaco y metales pesados (mercurio, cadmio, plomo, cromo, niquel, arsenico y selenio) (16). Los sabores más consumidos son frutales en un 34%, tabaco en un 16% y dulces en un 10% (1). Efecto genotóxico y daño oxidativo ocasionado por los cigarrillos electrónicos El daño percibido sobre el material genético a raíz de la exposición a cigarrillos electrónicos se encuentra aún en discusión (6,18,19). Sin embargo, se considera que los saborizantes, con dependencia de la dosis y la composición, son la causa principal de mutaciones puntuales, roturas de cadena simple y doble, alteraciones cromosómicas y conformación de micronúcleos, que aumentan en presencia de activación metabólica, en estudios realizados sobre una amplia gama de líneas celulares (BEAS 2B, TK6, CHO, A549, HBE, HEK 293, H9C2, HaCaT, H292, NHBE y V79, entre otras) y trabajos en animales, teniendo a ratones y ratas como modelos biológicos principales (1,20,21). Los sabores vaporizados de los e-líquidos no se metabolizan por completo en los pulmones y una porción de la dosis inhalada se absorbe en el torrente sanguíneo y se distribuye por todo el cuerpo (1), razón por la que los riesgos potenciales de la acción de vapear no se limitan a un daño localizado del sistema respiratorio, sino que pueden encontrarse en distintos tejidos. Muchos de los sabores usados en los dispositivos electrónicos han sido considerados genotóxicos o mutagénicos, estando la toxicidad de los e-líquidos directamente relacionada con estos, mas no con la presencia o concentración de nicotina (9,10,18). Cabe aclarar que los estudios in vitro en líneas celulares muchas veces reflejan el daño sobre la célula más que sobre el material genético y es así como ciertos valores de biomarcadores de efecto sobre el ADN, por ejemplo, aumentos del momento de cola en el ensayo cometa e incremento del porcentaje de micronúcleos, pueden enmascarar grados de citotoxicidad elevados, es decir, viabilidades celulares disminuidas, con presencia de eventos apoptóticos o necróticos (18). El daño oxidativo al igual que los efectos genotóxicos que alteran la integridad de la secuencia de ADN, han sido relacionados con los vapores de los e-líquidos por su reactividad oxidante y se cree que son directamente los oxidantes o especies reactivas de oxígeno los que se inhalan durante la acción de vapeo (4). En contraste con mediciones obtenidas mediante ensayo cometa o micronúcleos, el nivel de daño oxidativo registrado por exposición a vapores de cigarrillos electrónicos, ha sido similar e incluso superior a lo evidenciados por humo de cigarrillo convencional (22). Los sabores frutales y dulces se les han relacionado con mayor capacidad oxidativa que aquellos asociados a tabaco (4). Finalmente, es relevante mencionar que el daño oxidativo también se ha relacionado con el vapeo a altas potencias y parece no estar presente a bajas potencias (19), como es de esperar disminuye los niveles de glutatión y en general la actividad antioxidante celular, a la vez que los niveles de expresión de 8 oxoguanina ADN glicosilasa (OGG1) (22,23). Biomarcadores de efecto En materia de genética toxicológica un biomarcador de efecto es un parámetro biológico que refleja la interacción de un químico con el material genético. El ensayo cometa es una prueba sencilla y altamente sensible, en el que las células con mayor frecuencia de rupturas de cadena doble, cadena simple y sitios álcali lábiles muestran una migración significativa del ADN hacia el ánodo. El fundamento básico de la técnica es la migración del ADN en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis, con las cuales se tiene como resultado al observar los geles en el microscopio, que las células dañadas presentan la apariencia de un cometa, en donde la cabeza constituye la región nuclear con material genético intacto y la cola la conforman la migración de fragmentos de ADN originados por roturas y puntos sensibles al álcali (24). El largo o extensión de los cometas, es directamente proporcional al daño inducido sobre la doble hélice del ADN por el agente evaluado y es indicador de la sensibilidad de la prueba. La 8-hidroxi-2’-desoxiguanosina es uno de los principales productos de la oxidación del ADN formado por el radical hidroxilo. Es considerado una molécula pro-mutagénica y un marcador biológico de estrés oxidativo producidos por la interacción de 2’-desoxiguanosina con radicales OH. Entre las purinas y las pirimidinas, al parecer la guanina es la base nitrogenada con mayor susceptibilidad a la oxidación y es ampliamente reconocido que el radical libre de oxígeno con más impacto a nivel biomolecular es el hidroxilo. El 8-OHdG se puede detectar en muestras de tejido, plasma, suero y orina (22).