Diseño y caracterización de un andamio bioimprimible para la regeneración de tejido óseo

El complejo dentoalveolar juega un papel crucial en el desarrollo y mantenimiento de las principales funciones del cuerpo humano; este resulta ser una estructura compleja debido a la heterogeneidad de tejidos que componen la cavidad oral, y su composición se encuentra conformada por nervios, mecanorreceptores altamente especializados, ligamentos, esmalte, dentina, raíz, cemento y hueso alveolar ADDIN EN.CITE Salar Amoli2021207(Salar Amoli, EzEldeen, Jacobs, & Bloemen, 2021)20720717Salar Amoli, MehdiEzEldeen, MostafaJacobs, ReinhildeBloemen, Veerle %J BiomedicinesMaterials for Dentoalveolar Bioprinting: Current State of the Art7110120212227-9059(Salar Amoli, EzEldeen, Jacobs, & Bloemen, 2021). La pérdida ósea en la cavidad oral puede darse por diversos factores, tales como: anomalías congénitas, infecciones, exodoncias traumáticas, osteoneocrosis de los maxilares, cáncer oral y traumatismos ADDIN EN.CITE Pilipchuk2015192(Pilipchuk et al., 2015)19219217Pilipchuk, Sophia PPlonka, Alexandra BMonje, AlbertoTaut, Andrei DLanis, AlejandroKang, BenjaminGiannobile, William V %J Dental MaterialsTissue engineering for bone regeneration and osseointegration in the oral cavity317-33831420150109-5641(Pilipchuk et al., 2015). No obstante, esta pérdida ósea se produce en mayor frecuencia después de una infección bacteriana o como resultado de la pérdida de los dientes. Por ejemplo, la caries dental frecuentemente es el resultado de una infección por Streptococcus mutans, y puede avanzar hacia la pulpa dental, con eventual infección pulpar y necrosis ADDIN EN.CITE Jeffcoat1993189(Jeffcoat & Research, 1993)18918917Jeffcoat, Marjorie K %J Journal of BoneMineral ResearchBone loss in the oral cavityS467-S4738S219930884-0431(Jeffcoat & Research, 1993). Otras enfermedades orales importantes que provocan la pérdida ósea en la cavidad bucal son la enfermedad periodontal y la reabsorción del reborde residual, siendo la enfermedad periodontal la más prevalente ADDIN EN.CITE Nazir2017129(Nazir, 2017)12912917Nazir, Muhammad Ashraf %J International journal of health sciencesPrevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention721122017(Nazir, 2017). La pérdida de los tejidos de soporte del diente conlleva a la pérdida de éstos, provocando una disminución en la función masticatoria, afectando la apariencia y el bienestar psicológico de los pacientes ADDIN EN.CITE Hasmun202058(Hasmun et al., 2020)585817Hasmun, NorenVettore, Mario VLawson, Jennifer AElcock, ClaireZaitoun, HallaRodd, Helen D %J Journal of DentistryDeterminants of children’s oral health-related quality of life following aesthetic treatment of enamel opacities1033729820200300-5712(Hasmun et al., 2020). Por consiguiente, uno de los desafíos más grandes de la ingeniería de tejido óseo oral es el hecho de que el biomaterial estará expuesto al medio bucal, lo cual incluye una presencia de diversos patógenos ADDIN EN.CITE Roi2019206(Roi et al., 2019)20620617Roi, AlexandraArdelean, Lavinia CosminaRoi, Ciprian IoanBoia, Eugen-RaduBoia, SiminaRusu, Laura-Cristina %J MaterialsOral bone tissue engineering: Advanced biomaterials for cell adhesion, proliferation and differentiation229612142019(Roi et al., 2019). Por lo anterior, la ingeniería de tejidos pretende el desarrollo de andamios hechos de un biomaterial que actúe como la plantilla facilitadora de la unión celular, la proliferación, la diferenciación y la generación de una matriz extracelular, y que adicionalmente permita el transporte de oxígeno y nutrientes para el mantenimiento de la supervivencia celular y la orientación, que permita el crecimiento de las células que sean encapsuladas en dicho biomaterial. En este sentido se han logrado grandes avances en esta área mediante el desarrollo de sistemas complejos y estructuras conocidas como andamios compuestos, las cuales en conjunto comprenden: (i) biomateriales para la construcción del andamiaje que puedan imitar las propiedades de una matriz extracelular natural ADDIN EN.CITE Ojansivu2019222(Ojansivu et al.)22222217Ojansivu, MiinaRashad, AhmadAhlinder, AstridMassera, JonathanMishra, AyushSyverud, KristinFinne-Wistrand, AnnaMiettinen, SusannaMustafa, Kamal %J BiofabricationWood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin–alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells03501011320191758-5090(Ojansivu et al.). ( ADDIN EN.CITE Ojansivu2019222(Ojansivu et al.)22222217Ojansivu, MiinaRashad, AhmadAhlinder, AstridMassera, JonathanMishra, AyushSyverud, KristinFinne-Wistrand, AnnaMiettinen, SusannaMustafa, Kamal %J BiofabricationWood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin–alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells03501011320191758-5090ii) moléculas bioactivas tales como factores de crecimiento que permiten a las células multiplicarse (Ojansivu et al.). (iii) las células troncales mesenquimales capaces de diferenciarse ADDIN EN.CITE Patel20113(Patel, Bonde, & Srinivasan, 2011)3317Patel, HetalBonde, MinalSrinivasan, Ganga %J Trends Biomater Artif OrgansBiodegradable polymer scaffold for tissue engineering20-92512011(Patel, Bonde, & Srinivasan, 2011). Los biomateriales creados hasta la actualidad se han convertido en un área prometedora; sin embargo, aún es necesario estudios como el presente, para la optimización de éstos, pues algunos presentan limitaciones mecánicas y otras limitaciones biológicas. Si bien, el hueso es un material compuesto de moléculas orgánicas e inorgánicas, entre las cuales se encuentran fibrillas de colágeno que contienen nanohidroxiapatita, este tejido en condiciones saludables ha demostrado propiedades de autorremodelación y regeneración, las cuales se traducen en un alto potencial regenerativo en procesos de reabsorción y formación de hueso nuevo. Por esta razón, es necesario el desarrollo de un biomaterial que imite completamente las funcionalidades del hueso natural y que pueda funcionar como remplazo de éste en casos de pérdida. Para la fabricación de estos andamios se han empleado diferentes técnicas tales como liofilización, lixiviación de partículas, sol-gel, entre otros; sin embargo, factores como la porosidad, la heterogeneidad en el tamaño de estos, la arquitectura y la reproducibilidad de la técnica, son problemas que se presentan con este tipo de técnicas ADDIN EN.CITE Gul2019139(Gul, Arif, & Ghafoor, 2019)13913917Gul, MeishaArif, AyshaGhafoor, Robia %J Journal of Indian Society of PeriodontologyRole of three-dimensional printing in periodontal regeneration and repair: literature review5042362019(Gul, Arif, & Ghafoor, 2019). Es por esto por lo que han surgido alternativas tecnológicas tales como la fabricación aditiva o impresión 3D, en la cual se pueden construir estructuras complejas. Varias técnicas de fabricación de estructuras tridimensionales usadas en tejido óseo se han desarrollado; a continuación, en la Tabla 1, se establece un resumen de las más usadas y conocidas junto con sus ventajas y limitaciones: Tabla 1. Técnicas fabricación andamios ingeniería de tejido óseo Técnica Ventajas Limitaciones Referencia Gas-Foaming Método simple y de bajo costo, no requiere uso de solventes. Baja interconectividad en poros superficiales, las estructuras obtenidas tienen poros cerrados. ADDIN EN.CITE Wang2006208(Wang, Li, & Kumar, 2006)20820817Wang, XiaoxiLi, WeiKumar, Vipin %J BiomaterialsA method for solvent-free fabrication of porous polymer using solid-state foaming and ultrasound for tissue engineering applications1924-192927920060142-9612(Wang, Li, & Kumar, 2006) Separación de fases inducidas térmicamente Propiedades como: morfología, bioactividad y velocidad de degradación son fácilmente controlables. Debido al tamaño de poros obtenidos (10-100 micras) no es adecuado para tejido óseo, usa solventes para generación de fase líquido-líquido. ADDIN EN.CITE Soundarya2018209(Soundarya, Menon, Chandran, & Selvamurugan, 2018)20920917Soundarya, S PreethiMenon, A HarithaChandran, S VijiSelvamurugan, N %J International journal of biological macromoleculesBone tissue engineering: Scaffold preparation using chitosan and other biomaterials with different design and fabrication techniques1228-123911920180141-8130(Soundarya, Menon, Chandran, & Selvamurugan, 2018) Electrospinning Tienen una alta porosidad y gran superficie. Excelente similitud a las fibras de colágeno y a la ECM Requiere de un equipo especial para lograr el hilo, mejor desempeño y resultado en ambientes controlados con temperaturas y humedades específicas. ADDIN EN.CITE Cui2010210(Cui, Li, Xu, & Xu, 2010)21021017Cui, XiaojieLi, LumingXu, JunXu, Fu %J Journal of applied polymer scienceFabrication of continuous aligned polyvinylpyrrolidone fibers via electrospinning by elimination of the jet bending instability3676-3681116620100021-8995(Cui, Li, Xu, & Xu, 2010) ADDIN EN.CITE Qasim2019211(Qasim, Chae, & Lee, 2019)21121117Qasim, MuhammadChae, Dong SikLee, Nae Yoon %J International journal of nanomedicineAdvancements and frontiers in nano-based 3D and 4D scaffolds for bone and cartilage tissue engineering4333142019(Qasim, Chae, & Lee, 2019) Biorreactor Facilita la perfusión directa del medio de cultivo, se imitan las condiciones fisiológicas durante el cultivo. Técnica costosa, requiere insumos y factores de crecimientos precisos. ADDIN EN.CITE Chocholata2019205(Chocholata, Kulda, & Babuska, 2019)20520517Chocholata, PetraKulda, VlastimilBabuska, Vaclav %J MaterialsFabrication of scaffolds for bone-tissue regeneration5681242019(Chocholata, Kulda, & Babuska, 2019) Modelado por deposición fundida Alta porosidad, completa interconectividad de poros, posibilidad de controlar tamaño de poros, control de forma macro, buena resistencia a la compresión, libre de solvente. Altas temperaturas en proceso, rango limitado de materiales a usar, inconsistencia en poros. ADDIN EN.CITE Chocholata2019205(Chocholata et al., 2019)20520517Chocholata, PetraKulda, VlastimilBabuska, Vaclav %J MaterialsFabrication of scaffolds for bone-tissue regeneration5681242019(Chocholata et al., 2019) Sinterización por láser selectiva Obtención de estructuras complejas, posibilidad de controlar porosidad y tamaño de poros, amplia gama de materiales en polvo, libre de solventes. Altas temperaturas en proceso, solo se pueden usar polímeros térmicamente estables, limitado para tamaño de poros pequeños. (Chocholata et al., 2019) Sinterización de microesferas Excelentes propiedades mecánicas. Baja interconectividad y porosidad, temperatura y tiempo de sinterización, uso de solventes. ADDIN EN.CITE Shi2011212(Shi, Su, Varshney, Wang, & Wang, 2011)21221217Shi, XuetaoSu, KaiVarshney, Rohan RWang, YingjunWang, Dong-An %J Pharmaceutical researchSintered microsphere scaffolds for controlled release and tissue engineering1224-122828520111573-904X(Shi, Su, Varshney, Wang, & Wang, 2011) Criolitografía Alta rigidez a la compresión, alta viabilidad celular. Resolución limitada, materiales limitados para la técnica. ADDIN EN.CITE Ukpai2019213(Ukpai et al., 2019)21321317Ukpai, GideonSahyoun, JosephStuart, RobertWang, SkyXiao, ZichenRubinsky, Boris %J Journal of Medical DevicesA parallel multiple layer cryolithography device for the manufacture of biological material for tissue engineering13320191932-6181(Ukpai et al., 2019) Electro hidrodinámico Alta resolución, proceso de inyección continuo Biotintas de alta viscosidad (hasta 20% w/v). Usa altos voltajes, puede haber daño celular en la biotinta debido al voltaje. ADDIN EN.CITE Altun2019214(Altun, Ekren, Kuruca, & Gunduz, 2019)21421417Altun, EsraEkren, NazmiKuruca, Serap ErdemGunduz, Oguzhan %J Materials LettersCell studies on Electrohydrodynamic (EHD)-3D-bioprinted Bacterial Cellulose\Polycaprolactone scaffolds for tissue engineering163-16723420190167-577X(Altun, Ekren, Kuruca, & Gunduz, 2019) Magnetoforésis Altas densidades celulares. Efectos a largo plazo sobre salud celular debido a fluidos ferromagnéticos. ADDIN EN.CITE Tocchio2018215(Tocchio et al., 2018)21521517Tocchio, AlessandroDurmus, Naside GozdeSridhar, KaushikMani, VigneshwaranCoskun, BukreEl Assal, RamiDemirci, Utkan %J Advanced MaterialsMagnetically guided self‐assembly and coding of 3D living architectures170503430420180935-9648(Tocchio et al., 2018)ADDIN RW.CITE{{doc:619a90348f084b3a0cf38ba4 Tocchio,Alessandro 2018}} Materiales tales como la nanohidroxiapatita han sido ampliamente utilizados en aplicaciones biomédicas dada su excelente biocompatibilidad, bioafinidad y osteoconductividad ADDIN EN.CITE Thein-Han20096(Thein-Han & Misra, 2009)6617Thein-Han, WWMisra, RDK %J Acta biomaterialiaBiomimetic chitosan–nanohydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering1182-11975420091742-7061(Thein-Han & Misra, 2009). El quitosano provee una superficie que favorece la adhesión y la proliferación de osteoblastos, lo que permite acelerar el proceso de regeneración de hueso ADDIN EN.CITE Maji20157(Maji, Dasgupta, Kundu, & Bissoyi, 2015)7717Maji, KanchanDasgupta, SudipKundu, BiswanathBissoyi, Akalabya %J Journal of Biomaterials Science, Polymer EditionDevelopment of gelatin-chitosan-hydroxyapatite based bioactive bone scaffold with controlled pore size and mechanical strength1190-1209261620150920-5063(Maji, Dasgupta, Kundu, & Bissoyi, 2015). A su vez, la gelatina y el alginato han sido ampliamente usadas por su biodegradabilidad y baja antigenicidad. El colágeno es uno de los biomateriales más usados en ingeniería de tejidos; en su forma nativa este compone hasta el 70% del hueso y de matriz extracelular. La celulosa otorga propiedades mecánicas y reológicas a la biotinta, lo cual permite que esta pueda extruirse por medio de las boquillas del equipo de bioimpresión y generar un andamio que sea mecánicamente útil para hospedar células ADDIN EN.CITE Hickey2019216(Hickey, Pelling, & Biotechnology, 2019)21621617Hickey, Ryan JPelling, Andrew E %J Frontiers in BioengineeringBiotechnologyCellulose biomaterials for tissue engineering45720192296-4185(Hickey, Pelling, & Biotechnology, 2019). En la impresión 3D, los métodos de siembra de células convencionales tienen limitaciones, como la baja eficiencia de siembra y la distribución no homogénea de las células dentro del andamio. Con el mayor desarrollo de las tecnologías de impresión 3D, ahora es posible imprimir células simultáneamente con el material del andamio, denominado "bioimpresión 3D" que presenta diferentes ventajas tales como la distribución homogénea de células en el andamio y la capacidad de imprimir varias células en ubicaciones predeterminadas en un solo andamio ADDIN EN.CITE Piard2015191(Piard, Chen, Fisher, & Metabolism, 2015)19119117Piard, Charlotte MChen, YuFisher, John P %J Clinical Reviews in BoneMineral MetabolismCell-laden 3D printed scaffolds for bone tissue engineering245-25513420151559-0119(Piard, Chen, Fisher, & Metabolism, 2015). En el proceso de impresión, las células deben encapsularse en un hidrogel para poder protegerlas. Los hidrogeles son materiales 3D que tienen un alto contenido de agua; compuestos como la fibrina, el alginato, la celulosa y el metacrilato de gelatina (GelMA), han sido utilizado para la impresión celular. Cuando las células se encapsulan en un hidrogel, algunas funciones celulares pueden verse afectadas por las propiedades del hidrogel; además, durante el proceso de bioimpresión, las células pueden experimentar un esfuerzo cortante no deseado que puede afectar su función; es por esto que se requiere de la puesta a punto de andamios con componentes óptimos no citotóxicos, que protejan a las células durante su extrusión, e incluso que promuevan la multiplicación celular ADDIN EN.CITE Zamani2021181(Zamani et al., 2021)18118117Zamani, YasamanMohammadi, JavadAmoabediny, GhassemHelder, Marco NZandieh-Doulabi, BehrouzKlein-Nulend, Jenneke %J Regenerative EngineeringTranslational MedicineBioprinting of alginate-encapsulated pre-osteoblasts in PLGA/β-TCP scaffolds enhances cell retention but impairs osteogenic differentiation compared to cell seeding after 3D-printing485-4937420212364-4141(Zamani et al., 2021). Simultáneamente, el uso de factores de crecimiento como polímeros de fibrina favorecen la biocompatibilidad y la adhesión de las células al material ADDIN EN.CITE Aoyagi20128(Aoyagi et al., 2012)8817Aoyagi, YasuyukiKuroda, MasayukiAsada, SakiyoTanaka, ShigeakiKonno, ShunichiTanio, MasamiAso, MasayukiOkamoto, YoshitakaNakayama, ToshinoriSaito, Yasushi %J Experimental cell researchFibrin glue is a candidate scaffold for long-term therapeutic protein expression in spontaneously differentiated adipocytes in vitro8-15318120120014-4827(Aoyagi et al., 2012). En específico, se ha encontrado que la fibrina rica en plaquetas y leucocitos (L-PRF) es rica en factores de crecimiento y citocinas capaces de favorecer la proliferación y diferenciación celular ADDIN EN.CITE Fennis20029(Choi et al., 2005; Fennis, Stoelinga, Jansen, & surgery, 2002)9917Fennis, JPMStoelinga, PJWJansen, JA %J International journal of oralmaxillofacial surgeryMandibular reconstruction: a clinical and radiographic animal study on the use of autogenous scaffolds and platelet-rich plasma281-28631320020901-5027Choi200510101017Choi, B-HZhu, S-JKim, B-YHuh, J-YLee, S-HJung, J-H %J International journal of oralmaxillofacial surgeryEffect of platelet-rich plasma (PRP) concentration on the viability and proliferation of alveolar bone cells: an in vitro study420-42434420050901-5027(Choi et al., 2005; Fennis, Stoelinga, Jansen, & surgery, 2002). Por otro lado, las células troncales mesenquimales han sido muy estudiadas en esta área dada su capacidad de proliferación y diferenciación en células especializadas ADDIN EN.CITE Hu201861(Hu, Liu, & Wang, 2018)616117Hu, LLiu, YWang, S %J Oral diseasesStem cell‐based tooth and periodontal regeneration696-70524520181354-523X(Hu, Liu, & Wang, 2018). Las células troncales de pulpa dental se pueden aislar de dientes permanentes, supernumerarios y ectópicos; estas son utilizadas dadas sus propiedades odontogénicas, alto potencial angiogénico y osteogénico ADDIN EN.CITE Chew201962(Chew et al., 2019)626217Chew, Jacob Ren JieChuah, Shang JiunnTeo, Kristeen Ye WenZhang, ShipinLai, Ruenn ChaiFu, Jia HuiLim, Lum PengLim, Sai KiangToh, Wei Seong %J Acta biomaterialiaMesenchymal stem cell exosomes enhance periodontal ligament cell functions and promote periodontal regeneration252-2648920191742-7061(Chew et al., 2019). En el Centro de Investigaciones Odontológicas recientemente, en una tesis de maestría, se sintetizaron andamios tipo hidrogel que contenían nanohidroxiapatita, quitosano, gelatina y/o alginato modificado o no con L-PRF mediante la metodología empleada por Maji et. al (2015). La caracterización mostró hinchamiento con porcentajes de 38% a 45%, degradación de 30% a 42%; todos ellos mostraron presencia de poros interconectados con tamaños de 100 a 250 micras. Por otra parte, ninguno de los andamios fue citotóxico incluso, en los que contenían L-PRF las células se observaron adheridas viables, en contraste con los andamios que no tenían L-PRF. Fue así como el andamio compuesto de nanohidroxiapatita, quitosano, gelatina, alginato y L-PRF mostró las mejores características físicas y biológicas prometedoras para la regeneración ósea (manuscrito en sometimiento) ADDIN EN.CITE Anaya2022218(Anaya, 2022)21821836Anaya, LPontificia Universidad JaverianaDesarrollo y caracterización de un andamio compuesto de nanohidroxiapatita, quitosano, gelatina y/o alginato modificado o no con fibrina rica en plaquetas y leucocitos (L-PRF) para su potencial uso en regeneración de tejido óseo en cavidad bucalRepositorio Institucional2022https://repository.javeriana.edu.co/handle/10554/59295(Anaya, 2022); por lo cual, en el presente proyecto proponemos construir andamios similares, pero mediante técnicas altamente robustas como es la bioimpresión en 3D. Sin embargo, a la fecha son escasos los estudios de andamios bioactivos que cuenten con los tres componentes necesarios como son una matriz biocompatible, factores de crecimiento y probados con células mesenquimales de origen dental con propiedades osteogénicas para potencial uso en periodoncia y cirugía oral, que cuente con la presencia de poros indispensables para procesos regenerativos por favorecer la neovascularización, adhesión, proliferación y diferenciación celular; asimismo, el uso de nuevas tecnologías nos brinda reproducibilidad y escalabilidad ADDIN EN.CITE Jia2016219(Jia et al., 2016)21921917Jia, WeitaoGungor-Ozkerim, P SelcanZhang, Yu ShrikeYue, KanZhu, KaiLiu, WanjunPi, QingmentByambaa, BatzayaDokmeci, Mehmet RemziShin, Su Ryon %J BiomaterialsDirect 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink58-6810620160142-9612(Jia et al., 2016). Pregunta de investigación propuesta: ¿Es posible sintetizar un andamio bioimprimible a base de nanohidroxiapatita-quitosano-gelatina-alginato y celulosa-colágeno modificados con fibrina rica en plaquetas y leucocitos (L-PRF) que presente características físicas, químicas y biológicas óptimas para su potencial uso en regeneración ósea? Dentro del alcance de este trabajo, inicialmente se sintetizará y caracterizará el andamio descrito de manera física y mecánica, y posteriormente la biológica in vitro.