Determinación de los efectos tóxicos del tratamiento de hipertermia con nanopartículas de oro en células endoteliales como modelo simplificado de barrera hematoencefálica

Planteamiento del problema y justificación    En nanomedicina, partículas nanometricas (NPs) son usadas para administrar medicamentos, calor, e incluso campos magnéticos o de radiación en tejidos objetivo con fines específicos. Cuando se usan para administrar controladamente calor, el tratamiento se denomina hipertermia terapéutica (HT) [Huang, Roet, Seynhaeve]. La posibilidad de funcionalizar NPs para que entreguen medicamentos en células o proteínas objetivo, abre un panorama de opciones en las que el tejido sano puede permanecer seguro. Este nivel de localización y control conlleva el potencial de terapias más efectivas, con menores efectos colaterales para el paciente [NIOSH]. Sin embargo, al momento estas terapias no están disponibles en el mercado y se encuentran pocos ensayos clínicos de fase 1 [Clinical_trials]. Aún hay muchos problemas teóricos que resolver con respecto a la administración y control, puesto que los factores influyentes en las interacciones NP-tejido, no están del todo claros.     Con respecto a la administración, las NPs se encuentran con obstáculos para alcanzar su localización objetivo, los cuales constituyen la principal causa del detrimento en la efectividad de los tratamientos. Entre estos obstáculos se encuentran el paso por el sistema inmune, o barreras físicas como poros capilares, la barrera hematoencefálica (BBB: Blood-brain barrier), o la membrana celular. Lo anterior, combinado con interacciones microscópicas complejas entre NPs y sistemas de eliminación del organismo [Seynhaeve].  Particularmente, el paso a través de la BBB es de gran interés en tratamientos de diferentes patologías cerebrales. La BBB, conformada por células endoteliales, restringe el paso de sustancias, bacterias o virus al parénquima cerebral, previniendo diferentes tipos de enfermedades neurológicas. Allí, las células endoteliales de los capilares cerebrales están fuertemente conectadas por uniones estrechas (Tjs: tight junctions), que restringen selectivamente el tránsito de moléculas al cerebro, impidiendo también el paso de la mayoría de los fármacos. Entre las opciones para solventar esta dificultad, el uso de calor se posiciona como una prometedora alternativa [Fortin]; debido a que tiene la capacidad de dilatar espacios intercelulares y de desnaturalizar proteínas de las Tjs. Estas proteínas pertenecen a una familia llamada JAMs (Junctional adhesion molecules) cuyos tamaños son similares a los de las NPs, aproximadamente 2 nm [Liu].     Además de la deposición localizada de las NPs, esta tecnología de alta precisión requiere que su acción sea controlada para producir o no muerte celular, dependiendo del propósito de la terapia. Cuando el propósito de las NPs es administrar calor, los efectos infligidos dependen de un amplio espacio multiparamétrico, el cual incluye las propiedades de las NPs, del campo con el cual se irradian, y del sistema biológico en cuestión.  Esta diversidad de parámetros dificulta la comprensión de las relaciones causa-efecto, fundamental para el avance del campo y el diseño de terapias que involucran la desnaturalización controlada de proteínas celulares. Los resultados reportados en la literatura suelen ser altamente alentadores, pero más estudios preclínicos, teóricos y experimentales, son necesarios para que estas alternativas terapéuticas puedan llegar a la práctica clínica [Dogra, Gao, Roet].  En esta dirección, la modelación matemática mejora la comprensión del comportamiento de los nanomateriales en los sistemas biológicos desde principios fisicoquímicos, proveyendo entendimiento acerca de los mecanismos subyacentes y estableciendo relaciones cuantitativas importantes. Particularmente en el caso de HT, se requiere modelar las interacciones eléctricas y mecánicas entre las partículas y las células, como función de la temperatura.     En este proyecto interdisciplinario trabajaremos con nanopartículas de oro (AuNPs) debido a su alta biocompatibilidad, facilidad de fabricación, y a que han sido ampliamente probadas en investigaciones de nanomedicina [Stanley]. Adicionalmente, uno de los coinvestigadores tiene experiencia sintetizándolas y trabajando con ellas [Zutta]. Nuestro proyecto busca contribuir al entendimiento de la interacción entre las AuNPs y células endoteliales (como modelo de la BBB), a partir de la modelación física/matemática de los resultados experimentales obtenidos. Los resultados de este trabajo permitirán diferenciar y entender mejor, regímenes de parámetros que producen citotoxicidad y/o permeabilización en monocapas de células endoteliales, así como mejorar la comprensión de los fenómenos subyacentes a estos comportamientos.  Alcanzar este objetivo requiere de la revisión de las condiciones y parámetros físico-químicos y/o biológicos, que permiten y determinan el control en: (i) la producción y caracterización AuNPs con geometría y tamaño específicos, (ii) su aplicación en cultivos de células endoteliales, (iii) la distribución de temperatura en los cultivos celulares tratados con AuNPs, bajo radiación incoherente y coherente (iv) la citotoxicidad por hipertermia en dichos cultivos bajo los factoriales de los diferentes regímenes irradiación, concentración y tamaño de AuNPs.  Además de la relevancia que este proyecto tiene para el avance de tecnologías en el sector salud, la implementación de este proyecto conlleva la iniciación de un programa de desarrollo y producción de nanopartículas con fines médicos y potencialmente industriales en la Facultad de Ciencias.     Cabe resaltar que este proyecto preclínico busca contribuir en la generación del conocimiento necesario para el diseño de ensayos clínicos seguros, pero su impacto social no es inmediato. Sin embargo, su implementación ayudará a pavimentar el camino hacia la nanomedicina clínica rutinaria, lo cual traerá consigo terapias de precisión más efectivas con menores efectos colaterales. Esperamos también que el conocimiento generado nos permita generar colaboraciones futuras con personal médico para identificar oportunidades desde las limitaciones actuales, y así acercar el estado del arte hacia la implementación clínica de terapias con NPs.      Marco teórico y estado del arte     En términos de modelación física/matemática el problema de captación celular es fundamental para modelar la permeabilidad de la BBB in vitro. La internalización de las NPs en las células depende del tamaño y la concentración de partículas, y de la curvatura y tensión superficial de la membrana [Dogra, Gao]. Predicciones teóricas muestran que NPs pequeñas se internalizan agrupadas, NPs de tamaño intermedio tienden a agregarse linealmente, y NPs grandes son endocitadas individualmente [Yue]. Los cálculos (analíticos y numéricos) establecen que las partículas se agrupan para generar una contribución entálpica que supera la energía elástica y las barreras entrópicas de la vesícula [Jin]. El método de simulación comúnmente empleado, denominado Dinámica de partículas disipativas, describe estocásticamente moléculas o regiones fluidas sujetas a fuerzas conservadoras/disipativas aleatorias, que se mueven en espacio continuo y tiempo discreto. Los grados de libertad se modelan mediante fuerzas aleatorias, que conservan localmente el momento, garantizando un comportamiento hidrodinámico correcto [Khalatur, Yue]. Dentro de las alternativas analíticas existen modelos cinéticos para obtener las tasas de internalización/externalización (ecuaciones diferenciales acopladas en el tiempo), cuyos coeficientes se calculan mediante formalismos termodinámicos [Jin]. Adicionalmente se encuentran modelos termodinámicos que calculan el número de partículas endocitadas en condiciones de equilibrio, mediante la minimización de un funcional de energía libre del sistema [Wang, Zhang].     Cuando la nanoterapia consta de partículas para HT, es necesario calcular la producción de calor por efecto plasmónico, y entender sus efectos sobre las células. El calor se genera por excitación de plasmones localizados en la superficie de las NPs. Estos son cuantos de oscilación de plasma confinados entre la superficie del metal y el medio dieléctrico [Mayer]. En el acoplamiento entre la radiación electromagnética incidente y el plasma se generan cuasipartículas llamadas plasmón-polaritón y plasmón localizado. Los plasmones localizados surgen naturalmente en superficies curvas de partículas con tamaños menores a la longitud de onda del campo incidente (r