Descripción del perfil de expresión génica de dos poblaciones de células madre adultas con orígenes embrionarios distintos

Planteamiento del problema El concepto de células madre del estroma mesenquimal medular (MSC, del inglés mesenchymal stem cell) se originó a partir de los estudios de Friedestein de investigaciones centradas en la médula ósea post-natal, comprobando que después de un trasplante heterotópico de células de médula ósea en la capsula renal de un modelo murino se desarrollaba un huesecillo ectópico. De esta manera se mostró por primera vez la presencia de células clonogénicas con capacidad multipotencial, gracias a su diferenciación en osteoblastos, condrocitos, adipocitos y estroma de soporte hematopoyético (1,2). Posteriormente otros investigadores especularon que las MSCs podrían dar origen a células de origen mesodérmico, además de las anteriormente descritas e inclusive diferenciarse en células de otro linaje celular. El término MSC inicialmente propuesto por Friedenstein no ha tenido el rigor científico que se requiere para definirlas como células madre del mesénquima obtenidas del estroma de médula ósea. Es así como el concepto inicial se ha modificado sin evidencia experimental. Más aún, el término mesénquima hace referencia a un término histológico para describir un tejido de transición embriológico, que no es sinónimo de mesodermo (3). En un esfuerzo para establecer un consenso general acerca de las MSCs aisladas de tejidos adultos, en 2006 la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT, del inglés International Society for Cellular Therapy) propuso una serie de criterios para definir las MSCs. Entre estos criterios se incluyen: Adherencia al plástico en condiciones de cultivo estándar, la expresión de los marcadores de superficie celular CD105, CD90 y CD73; ausencia de expresión de marcadores hematopoyéticos como CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a, CD19 y HLA-DR, y poseer la capacidad de ser inducidas para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos in vitro (4). No obstante, se sabe que un cultivo celular in vitro puede modificar las propiedades de expresión de los marcadores de superficie celular y no reflejar las verdaderas características de las MSCs. Adicionalmente, a pesar de que ha transcurrido una década y media, los criterios utilizados no definen con exactitud la población de células madre estromales de medula ósea, y varias publicaciones reportan investigaciones con las anteriores pautas, las cuales no validan esta población celular (3). Por los antecedentes históricos acerca de la verdadera definición de una célula aislada del estroma de médula ósea, y las diversas propiedades terapéuticas que se le atribuyen a esta población celular, es importante conocer su naturaleza. A la fecha muchos investigadores con intenciones de utilizar las células madre en un contexto traslacional, siguen las pautas establecidas por la ISCT 2006, a pesar de estar obsoletas. Es por esto, que nuestro grupo de investigación ha venido realizando estudios en busca de dilucidar el fenotipo a través de marcadores de superficie celular en elementos óseos del esqueleto axial y apendicular. Para una primera fase del estudio se realizó una revisión de alcance en la literatura teniendo en cuenta publicaciones entre 1994 y 2021. Se encontró que efectivamente los marcadores de superficie celular sugeridos por la ISCT de 2006 siguen siendo los más utilizados en la literatura (CD105, CD90 y CD73), seguidos por otros marcadores como CD44, CD166, CD29, STRO-1, CD146 y CD271 (5). En una segunda fase, se recolectaron bloques de parafina de elementos óseos de embriones, fetos y mortinatos para evaluar en primera instancia la histología en vertebras, costillas, esternones y cintura pélvica, describiendo los tipos celulares en cada tejido y los procesos del desarrollo. Por último, en la actualidad nos encontramos realizando evaluación de los marcadores de superficie celular determinados en la revisión de alcance en los tejidos recolectados. Mediante esta propuesta queremos contrastar los marcadores observados durante procesos del desarrollo gestacional en comparación con los de tejidos adultos. Por otra parte, en la actualidad grupos de investigación obtienen células madre de origen dental principalmente de pulpa dental, incluso pueden adquirirse comercialmente (DPSC, por sus siglas en inglés Dental Pulp stem cells de LONZA®). Las DPSC provienen de cresta neural distinto origen embrionario a las del esqueleto apendicular y axial (placa lateral del mesodermo y somitos, respectivamente). Otra notable característica de las DPSC que las diferencia de las obtenidas de médula ósea es su amplio potencial de diferenciación hacia condroblastos, mioblastos, fibroblastos, células nerviosas, adipocitos, células endoteliales, cementoblastos y odontoblastos. Sin embargo, su caracterización fenotípica se centra en lo propuesto por la ISCT para las MSC y las reportadas por la casa comercial (6), por lo cual en el grupo de investigación en estas mismas células realizamos un estudio preliminar con otros marcadores de superficie como CD146, CD164 y podoplanina (PDPN) obteniendo positividad en más del 90%, además de la presencia de marcadores de pluripotencia como OCT3/4 y SOX2 en la misma proporción y cerca del 50% para SSEA-4 hallazgo llamativo puesto que las obtenidas de médula ósea requieren protocolos especiales para inducir esta pluripotencia. Finalmente, en los ensayos in vitro evidenciamos células con alta capacidad proliferativa, capaz de la formación de unidades formadoras de colonias (UFCs), establecimiento de clones derivados de colonias únicas y diferenciación osteogénica, características que no siempre se obtiene con la misma eficiencia. Teniendo en cuenta lo anteriormente mencionado, sobre algunas diferencias fenotípicas entre las células madre de médula ósea y las de origen de pulpa dental, a la fecha no queda claro sí existen diferencias en la expresión de marcadores de superficie celular más amplio al sugerido por ISCT y en perfiles de expresión génica de estas dos poblaciones celulares (MSC y DPSC) obtenidas a partir de cultivos primarios de miembros superiores y pulpa dental de terceros molares caracterizados en tasa proliferación, UFCs, clonogenicidad y marcadores de superficie. Por lo tanto, el presente proyecto busca contrastar los marcadores de superficie celular y la expresión génica diferencial de resultados obtenidos experimentalmente en cultivos primarios con el fin de establecer una mejor caracterización que las defina como células madre y su potencial uso en estrategias de regeneración tisular. Justificación Las células denominadas MSCs están siendo utilizadas como opciones terapéuticas a nivel mundial, no obstante, existe una gran confusión acerca de la definición de células madre MSCs (7). En la comunidad científica hay falta de criterios comunes como biomarcadores que permitan identificarlas como células con capacidad de auto-renovación y diferenciación. Adicionalmente, antes de pensar en fines terapéuticos, es crítico garantizar la calidad de las MSCs o DPSCs. Un reporte en la literatura demostró para ocho laboratorios con buenas prácticas de manufactura de células del estroma de medula ósea alta variabilidad en los procesos de aislamiento y cultivo (8). En 2006, teniendo en cuenta el considerable potencial terapéutico de las células humanas multipotentes con características mesenquimales aisladas del estroma, el comité de la International Society for Cellular Therapy (ISCT) propuso una serie de criterios mínimos para definir una célula mesenquimal con multipotencial de diferenciación (4). Se creía que criterios mínimos como la adherencia al plástico, marcadores comunes de superficie y tinciones positivas de cultivos in vitro luego de diferenciación condrogénica, osteogénica y adipogénica ayudarían con caracterizaciones más homogéneas de las posibles células madre esqueléticas. Sin embargo, en la actualidad se ha evidenciado que los criterios propuestos por la ISCT no definen una célula madre esquelética soportado por varias publicaciones (3). Es por lo anterior, que mediante el presente proyecto se busca realizar cultivos primarios de células madre a partir de remanentes óseos de procedimientos quirúrgicos en miembros superiores para obtener MSC y terceros molares para obtener DPSC, mediante el cultivo de estas células serán caracterizadas ambas poblaciones en cuanto a sus tasas proliferativas, UFCs, clonogenicidad, panel ampliado de marcadores de superficie y posterior análisis transcriptómicos, puesto que los marcadores de superficie celular son heterogéneos en su función y no definen específicamente una posible célula madre, de allí que se deba recurrir a este tipo de análisis masivos con secuenciación de próxima generación.