Correlación in vitro de la respuesta de células de la pulpa dental a estímulos eléctricos y térmicos utilizando microelectrodos vs. viabilidad celular, como una aproximación para un diagnóstico diferencial entre la pulpitis reversible e irreversible.

Project: Research

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La pulpa dental es una estructura formada por tejido conectivo, neurovascular y por células como histiocitos, macrófagos, linfocitos, mesenquimales diferenciadas, fibroblastos y odontoblastos. Los Odontoblastos son las células especializadas en formar la dentina, poseen una prolongación citoplasmática llamada proceso de Tome’s, que se extiende al interior de los túbulos dentinales y mide entre 50-60 µm. El cuerpo del odontoblasto se encuentra en la periferia de la pulpa dental, por lo que son las primeras células de defensa de la pulpa ante invasiones bacterianas (1,2). Son células posmitoticas altamente diferenciadas que se originan de la cresta neural y se consideran células sensoras debido a la capacidad de reconocer una invasión bacteriana a través de receptores Toll-like en su superficie. Una vez los odontoblastos reconocen las bacterias emiten una reacción inflamatoria secretando factores principalmente quimioquinas. Estas células, también pueden detectar estímulos como el frio, el calor, las fuerzas mecánicas, estímulos eléctricos entre otros, gracias a axones sensoriales que se encuentran embebidos entre la capa del esmalte y la dentina, como también por medio de la expresión de canales de iones como potenciales receptores transitorios mecano-y/o termosensibles que probablemente detectan calor y/o frío o movimientos del líquido dentario dentro de los túbulos dentinales (3,4). De otra parte, los odontoblastos se encuentran también en estrecha asociación con las terminaciones nerviosas por lo que son capaces de transducir la señal nociva a las fibras nerviosas circundantes, mediante la despolarización de la membrana neuronal, ya que contiene todos los elementos necesarios implicados en mecano transducción y nocicepción, lo que los hace candidatos adecuados para detectar estímulos externos y mediar en la sensación del dolor dental (5-7). Otras células de la pulpa dental como los fibroblastos son los más abundantes de este tejido, y le dan soporte estructural a este. Tienen la capacidad de secretar y responder con citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento (IL-6, IL-8, MCP-1, M-CSF y ICAM-1) (8) cuando son injuriadas, con el fin de mantener la homeostasis del tejido pulpar. Los fibroblastos de la pulpa dental humana participan en la progresion de la pulpitis (inflamación pulpar) por medio de la sintesis de IL-6 y cox 2 (9,10), forman parte del tejido conectivo y son los encargados de producir las fibras colágenas, principal componente proteico de la pulpa dental y de participar en el desarrollo de la pulpitis, hasta llegar a la necrosis (8). En el momento en que la pulpa sufre estímulos externos entre ellos bacterias que producen la caries dental, una de las principales el S. mutans, se produce su inflamación llamada “pulpitis” que puede ser reversible o irreversible. Es reversible cuando al retirar el estímulo nocivo, la pulpa vuelve a su normalidad e irreversible si la pulpa es dañada hasta resultar en la muerte pulpar. El diferenciar clínicamente y de forma acertada el dolor entre la pulpitis reversible o irreversible no ha sido posible (11). Zanini et al 2017 demostraron que desde el punto de vista biológico la diferencia entre la pulpitis reversible e irreversible está relacionada también con los niveles específicos de expresión de mediadores inflamatorios in situ, encontrando que la interleucina IL-8, la metaloproteinasa MMP-9 y el factor de necrosis tumoral α aumentan su expresión en pulpitis irreversible con respecto a las pulpas sanas (12). Otros estudios también reportaron que la IL 1b, TNFα, IL4, L1a, VEGF-α, y FGF aumentan su expresión durante el proceso de inflamación pulpar (13). Así mismo existen una serie de enzimas que participan en el proceso inflamatorio y el dolor, tal como el aspartato aminotransferasa (AST) una enzima citoplasmática que se presenta extracelularmente y es un signo de necrosis celular y la fosfatasa alcalina (ALP) importante en inducir eventos de mineralización, ha mostrado un papel importante en la respuesta pulpar inicial después de una injuria (14) Los umbrales del dolor varían en las diferentes zonas del diente ya que de acuerdo a los estímulos ya sean osmóticos, iónicos, térmicos y eléctricos se involucran distintos mecanismos para causar la excitación nerviosa de la pulpa dental. Si bien el dolor es uno de los principales síntomas de infección/inflamación, su presencia o intensidad no se correlaciona precisamente con la afectación del tejido pulpar, extensión y gravedad del estado histopatológico, ya que la necrosis pulpar puede ocurrir en pacientes asintomáticos o sintomáticos de bajo grado, diagnosticándose erróneamente como una pulpitis reversible (15). Existen diferentes pruebas para el diagnóstico del estado pulpar, las cuales consisten en el uso de medios físicos como el calor y el frio que utilizan la aplicación de agentes que incrementan o disminuyen la temperatura. Entre estos agentes, se encuentran la gutapercha caliente, el hielo, refrigerantes en spray y dióxido de carbono frio (hielo seco) los cuales deben ser utilizados con especial cuidado por sus posibles efectos dañinos sobre la mucosa y la formación de fisuras en el esmalte (16-23). Otras pruebas como el test eléctrico pulpar, trabaja sobre la premisa del estímulo eléctrico, causando un cambio a través de la membrana neural induciendo así a una respuesta de los nervios no mielinizados. Esta técnica debe ser usada correctamente con el fin de lograr respuestas fiables, ya que depende de la adecuada colocación del dispositivo en el área que se quiere estudiar y del uso de un medio conductor como la pasta dental, ya que puede llegar a producir falsos resultados en dientes inmaduros (24). El test de la cavidad ha sido sugerido como el último recurso a utilizar, ya que toca realizar una preparación de una cavidad sin anestesia local, para obtener alguna indicación de sensibilidad. Sin embargo, esta prueba no ofrece una mayor información que la que ofrecen las pruebas térmicas y en cambio produce una pérdida de tejido dental irreparable (25, 26). El test que se maneja actualmente para determinar si hay pulpitis reversible o irreversible es un instrumento de medición llamado vitalometro que utiliza el envío de una corriente pulsada al diente con una escala de intensidades a las que responde el paciente con diferentes sensaciones pulpares de dolor. El problema de este equipo radica principalmente, en el número de variables que pueden influenciar el umbral del paciente lo que modifica su capacidad de respuesta y dificulta la interpretación de su percepción a este, convirtiéndose posiblemente en una prueba muy subjetiva. Desde una perspectiva técnica, todas las pruebas pulpares actuales tienen carencias en términos de exactitud, fiabilidad y reproducibilidad de un diagnóstico por lo que se requieren más estudios que permitan correlacionar las señales y el estado real de vitalidad de las células pulpares, que conduzcan a la construcción de un dispositivo más acertado y fiable en el diagnostico endodóntico (27-29) Por lo cual el uso de sensores se convierte en una alternativa para evaluar los estados de inflamación pulpar. Un sensor se entiende como un dispositivo que capta un parámetro ya sea físico o químico (temperatura, humedad, presión, sonido, radiación etc.) como señal de entrada, y esta es traducida a una señal eléctrica de salida para su posterior tratamiento ya sea por medio de circuitos electrónicos, software, instrumentos de medición etc. Los microelectrodos que se propone en este trabajo son un arreglo matricial de 36 electrodos, que permiten contactar al mismo tiempo varios puntos de un cultivo celular para estimular y medir su respuesta eléctrica extracelular, este tipo de electrodos han sido utilizados para detectar actividad celular en neuronas, células cardiacas, músculos, etc. (30) Las células o tejidos debido a su propia naturaleza pueden verse como receptores, canales de iones, enzimas, que son extremadamente sensibles a estímulos externos. Las células son, por su complejidad, como micro-laboratorios en las cuales ocurren diferentes procesos bioquímicos. La actividad celular por otra parte puede ser medida por diferentes técnicas como: fluorescencia óptica, impedancia eléctrica en la membrana, detección de radiación infraroja debido a actividad térmica, etc. Un ejemplo bastante ilustrativo de estímulo y respuesta en un sistema biológico se puede observar en el sistema nervioso (31). En este estudio se plantea evaluar in vitro la respuesta de células pulpares Odontoblastos (primera línea de defensa de la pulpa dental) y Fibroblastos (involucrados en la progresión de la pulpitis) a estímulos térmicos (reproducen las condiciones que estimulan el dolor) y eléctricos (indican sensibilidad pulpar) a través de microelectrodos. Esta evaluación se hará una vez estas células sean expuestas a bacterias cariogenicas que induzcan los estados de pulpitis reversible e irreversible. Estos estados de pulpitis serán identificados utilizando marcadores de inflamación específicos (reportados en la literatura) que serán leídos a través de citometría de flujo y la viabilidad de las células será evaluada en los diferentes estadios por microscopia de fluorescencia y MTT, para posteriormente establecer una correlación entre las respuestas a estos estímulos y el estado de viabilidad de las células.
StatusActive
Effective start/end date01/11/2330/04/25

Project Status

  • In Execution

Project funding

  • Internal
  • Pontificia Universidad Javeriana